DLC2生理學(xué)特性及其與血管生成相關(guān)性的研究.pdf

1、研究背景：黏著斑(focal adhesion)是一個以整合素(integrin)為中心的蛋白分子復(fù)合體，整合素的胞內(nèi)段與肌動蛋白細胞骨架(微絲)接合，胞外段與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)結(jié)合，從而實現(xiàn)細胞和細胞外基質(zhì)的相互黏附，并參與信號胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細胞遷移、增殖、分化、死亡和基因表達。整合素胞內(nèi)段與肌動蛋白(actin)的接合必需借助于一系列蛋白，這些蛋白被稱為黏著斑相關(guān)蛋白。DLC(Delete

2、d in liver cancer)蛋白亞家族即屬于黏著斑相關(guān)蛋白。DLC目前有三個成員：DLC1、DLC2和DLC3，它們具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)：由SAM功能域、RhoGAP功能域和START功能域組成。DLC含有RhoGAP功能域，因而也屬于Rho GTP酶激活蛋白家族(Rho GAPs)，這些蛋白的主要功能與其RhoGTP酶蛋白(RhoGAP)活性有關(guān)。DLC1是DLC第一個成員，對它的研究也最全面。DLC1是在對肝癌染色體缺失片段的

3、研究中被發(fā)現(xiàn)并克隆的。DLC1被認為屬于抑癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。DLC1參與調(diào)節(jié)細胞形態(tài)、黏附、遷移、增殖和死亡。在DLC1缺失的細胞中重表達DLC1可有效的抑制細胞生長。DLC1基因敲除小鼠胚胎在10.5dpe(dayspost coitum)后不能存活。DLC2，別名STARD13，于2003年被成功克隆，它與DLC1有相似的蛋白結(jié)構(gòu)，也在多種腫瘤中表達下調(diào)，亦可通過其RhoGAP結(jié)構(gòu)域抑制腫瘤細胞的生長，因而也被認為

4、是一個潛在的抑癌基因。但是，DLC2在功能上是否與DLC1有不同，是否是一個冗余基因，我們尚無答案。目前對于DLC2的研究尚處起步階段，尚未建立DLC2表達譜，對DLC2的潛在抑癌作用機制和其它生理學(xué)功能的了解也非常貧乏。
　　 研究內(nèi)容：在本研究中，我們擬對DLC2的基本生物學(xué)特征進行較全面的研究，包括建立DLC2基因敲除小鼠模型；借助基因報告-敲除系統(tǒng)，描繪小鼠體內(nèi)DLC2的表達譜，同時研究DLC2基因缺失后對小鼠體內(nèi)血管生

5、成等的影響。此外，我們還要在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上進一步研究DLC2在內(nèi)皮細胞中的功能以及它與血管生成之間的關(guān)系，并探討了DLC2調(diào)控血管生成的機制，為明確DLC2的生理學(xué)功能和抑癌作用機制，以及將DLC2應(yīng)用于抗腫瘤治療的靶點奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 本研究分為四個部分：
　　 第一章 DLC2基因結(jié)構(gòu)、序列特征和表達特點。
　　 目的：了解DLC2的基本生物學(xué)特征和表達情況。
　　 方法：⑴通過生物信息學(xué)

6、方法分析DLC2基因結(jié)構(gòu)和分子序列的特征；⑵采用實時定量PCR在mRNA水平檢測小鼠各個組織器官中DLC2的表達情況；⑶采用實時定量PCR在mRNA水平檢測人惡性腫瘤eDNA樣本(腎癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、胃癌和食管癌)中DLC2的表達情況；⑷制備特異性抗DLC2抗體，在蛋白水平檢測結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌細胞系中DLC2的表達情況；⑸構(gòu)建GFP-DLC2融合蛋白，研究DLC2的亞細胞定位。
　　 結(jié)果及結(jié)論

7、：①DLC2屬于Rho GTPase-activating proteins(GAPs)家族成員，它的蛋白分子結(jié)構(gòu)中包括SAM、RhoGAP和START三個結(jié)構(gòu)域，DLC2的生理學(xué)功能可能與RhoGAP結(jié)構(gòu)域活性密切相關(guān)；②DLC2在小鼠肺組織中有較高轉(zhuǎn)錄水平，在脾和骨骼肌中無表達；③DLC2在人乳腺癌和前列腺癌中表達下調(diào)，提示DLC2可能作為抑癌基因參與乳腺癌和前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程；④DLC2通過N'端定位于黏著斑，包括SAM結(jié)構(gòu)

8、域、FAT結(jié)構(gòu)序列，但具體負責(zé)結(jié)合的部位和酪氨酸位點尚需進一步研究。
　　 第二章 DLC2基因敲除小鼠模型的建立和DLC2組織分布特點。
　　 目的：建立DLC2基因敲除小鼠模型，觀察DLC2缺失表型及DLC2表達特征，從中推測DLC2的生理學(xué)功能。
　　 方法：⑴在小鼠胚胎干細胞中通過同源重組的原理用敲除靶載體取代內(nèi)源DLC2基因，建立DLC2基因敲除小鼠模型；⑵采用PCR方法分析小鼠基因型并觀察DLC2基因

9、敲除小鼠的表型；⑶采用免疫沉淀方法確定DLC2在基因敲除小鼠模型中完全缺失；⑷采用X-Gal染色檢測DLC2在小鼠各個組織器官中的原位表達情況；⑸采用連續(xù)切片X-gal、CD31免疫組織化學(xué)染色確定DLC2在血管中的表達定位。
　　 結(jié)果及結(jié)論：①DLC2基因報告-敲除小鼠模型構(gòu)建成功；②DLC2基因敲除小鼠可正常發(fā)育、成年和繁殖，未發(fā)現(xiàn)異常表型，提示DLC2對小鼠的生長發(fā)育繁殖可能不是必需的；③DLC2在小鼠肺、肝等組織高表達

10、；④DLC2在小鼠內(nèi)皮細胞中高表達，提示DLC2可能參與血管生成反應(yīng)過程。
　　 第三章 DLC2與血管生成關(guān)系的觀察。
　　 目的：利用DLC2基因敲除小鼠模型，觀察DLC2與血管生成的關(guān)系，探討DLC2在小鼠內(nèi)皮細胞中高表達的生理學(xué)意義。
　　 方法：⑴通過基質(zhì)膠血管生成誘導(dǎo)實驗和動脈環(huán)種植實驗，觀察DLC2缺失對內(nèi)皮細胞遷移和血管生成的作用；⑵通過小鼠皮膚創(chuàng)傷實驗觀察DLC2缺失對創(chuàng)傷誘導(dǎo)的血管生成的作用；

11、⑶建立B16腫瘤移植模型，觀察DLC2缺失對腫瘤誘導(dǎo)的血管生成的作用。
　　 結(jié)果及結(jié)論：DLC2基因敲除小鼠對基質(zhì)膠和腫瘤細胞誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)較野生型小鼠強，但是DLC2基因敲除小鼠對創(chuàng)傷誘導(dǎo)的血管生成與野生型小鼠對比無明顯差異，說明DLC2參與某些類型血管生成反應(yīng)，如腫瘤誘導(dǎo)的血管生成過程。
　　 第四章 DLC2缺失促進血管生成機制的探討。
　　 目的：探討DLC2缺失是否通過影響內(nèi)皮細胞遷移和黏附能力而

12、參與調(diào)控血管生成的過程；RhoGAP是否是DLC2實現(xiàn)功能調(diào)控的關(guān)鍵機制。
　　 方法：⑴采用RNAi技術(shù)沉默DLC2在內(nèi)皮細胞系HUVEC中的表達，觀察DLC2缺失對內(nèi)皮細胞黏附、遷移和小管形成能力的影響；⑵采用雙重RNAi技術(shù)觀察RhoA活性的下調(diào)對DLC2缺失表型的逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)果及結(jié)論：①在內(nèi)皮細胞中沉默DLC2可削弱細胞黏附能力，促進細胞遷移和小管形成；②以上作用可被RhoA沉默逆轉(zhuǎn)，表明DLC2對血管生成的

13、調(diào)控是通過RhoA途徑實現(xiàn)的。
　　 全文小結(jié)：DLC2屬Rho GTP酶激活蛋白，它定位于黏著斑，并且在血管內(nèi)皮細胞中高表達。DLC2對于小鼠胚胎的發(fā)育并非必需，但是它通過影響內(nèi)皮細胞黏附、遷移和小管形成能力，參與血管生成的調(diào)控，此調(diào)控是通過其RhoGAP活性實現(xiàn)的。本研究第一次闡述了DLC2和血管生成的關(guān)系，揭示了DLC亞家族在生理學(xué)上的新功能，為黏著斑參與細胞生理學(xué)功能的調(diào)控做出了更進一步的分析，也為DLC2應(yīng)用于抗腫瘤靶