荸薺上攜帶病毒種類的鑒定及其分子生物學(xué)特性研究.pdf

1、荸薺是一種營養(yǎng)價值很高的水生蔬菜，廣泛種植于世界各地，一經(jīng)病毒感染會嚴(yán)重影響其品質(zhì)和產(chǎn)量，使?fàn)I養(yǎng)價值降低。近年來，小RNA深度測序以及生物信息學(xué)分析是鑒定植物病毒的一種高效方法。本研究自2013年至2015年通過對來源于產(chǎn)區(qū)湖北團風(fēng)縣和廣西農(nóng)科院資源圃的荸薺樣品進行了疑似病毒病害調(diào)查，采集其葉狀莖材料進行小RNA深度測序及其生物信息學(xué)分析，PCR擴增及其序列分析獲得一種整合于荸薺基因組中的內(nèi)源性DNA病毒以及2種+ssRNA病毒，明確了

2、以上3種病毒的分子特性;具體取得的結(jié)果如下:
　　1.首次報道荸薺上攜帶屬于大豆褪綠斑駁病毒屬（Soymovirus）的一種內(nèi)源DNA病毒新成員（WCSV-1）。
　　荸薺DNA病毒的基因組全長為7，535 bp，與花椰菜花葉病毒科（Caulimoviridae）成員的序列相似性為42％～52％，推導(dǎo)含有9個ORFs，分別編碼MP、CP、RT、轉(zhuǎn)錄激活因子及其他5個假定蛋白，具有與花椰菜花葉病毒科成員類似的保守結(jié)構(gòu)域。基于基

3、因組核酸序列和氨基酸序列分析表明該病毒為大豆褪綠斑駁病毒屬（Soymovirus）的一個新成員，暫命名為Water Chestnut Soymovirus-1(WCSV-1)。通過對WCSV-1以及Caulimoviridae成員基因組ORFⅠ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ編碼的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果表明，WCSV-1與Soymovirus成員聚為同一組不同分支，推測WCSV-1為該屬一個新種。對sRNAs的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)來源

4、于病毒的sRNAs（vsRNAs）長度大小以22 nt最多，5'末端位置的核苷酸偏向以“U”為主，vsRNAs在WCSV-1基因組正義鏈和負(fù)義鏈上的數(shù)量分布是不均勻的。對采集自湖北省和廣西省種植區(qū)以及資源圃不同品種的荸薺樣品不同組織部位及其離體植株進行PCR檢測，結(jié)果表明，攜帶WCSV-1樣品陽性率為100％。對來源于不同地區(qū)、不同品種的荸薺樣品，分別提取其葉狀莖、球莖和根系部位的基因組DNA，用來源于WCSV-1的ORFⅠ和ORFⅣ區(qū)

5、域的序列標(biāo)記的探針進行Southern雜交，結(jié)果表明，WCSV-1序列整合到荸薺寄主基因組中。
　　2.鑒定了荸薺感染2種+ssRNA病毒（暫命名為WCV-1和WCV-2）明確其分子特性及其分類地位。
　　對采集自廣西農(nóng)科院資源圃樣品進行小RNA測序及數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)樣品中潛帶兩種新的正單鏈RNA病毒，暫且命名為water chestnut virus-1(WCV-1)和waterchestnut virus-2(WCV-2)。

6、利用數(shù)據(jù)拼接得到的contigs設(shè)計引物對其序列進行擴增，已獲得WCV-1基因組長度為12，663 nt，WCV-1基因組含有的開放閱讀框編碼甲基轉(zhuǎn)移酶(Met)、解旋酶(Hel)、依賴RNA的RNA聚合酶（RdRp）、熱激70蛋白類似物(HSP70h)、熱激90蛋白類似物(HSP90h)等蛋白。基于RdRp和HSP70h氨基酸序列分析，WCV-1與長線形病毒科（Closteroviridae）其他成員的相似性分別為29％～39％和27

7、％～37％;進化樹分析顯示，WCV-1獨立為一個組群，推測WCV-1為Closteroviridae的一個新成員。
　　另外，WCV-2已獲得基因組序列長度為9，269 nt; WCV-2基因組編碼的一個開放閱讀框主要有外殼蛋白(CPs)、NTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NTP-binding domin)、蛋白酶(Pro)、依賴RNA的RNA聚合酶（RdRp）等保守結(jié)構(gòu)域;基于氨基酸序列的相似性比較和Prot-Pol區(qū)域的系統(tǒng)進化分析，WCV

8、-2與伴生豇豆病毒科（Secoviridae）水稻矮化病毒屬（Waikavirus）成員相似性最高，為55％～57％，在系統(tǒng)進化中與該屬其它成員聚集為獨立分支，推測WCV-2為伴生豇豆病毒科（Secoviridae）水稻矮化病毒屬（Waikavirus）一個新成員。
　　此外，基于WCV-1 HSP70h保守區(qū)域以及WCV-2 RdRp區(qū)域設(shè)計引物對采集自湖北團風(fēng)和廣西農(nóng)科院的樣品進行檢測。結(jié)果表明，湖北21份樣品中有1份樣品攜帶