細(xì)粒棘球蚴EgG1Y162抗原基因的序列分析及其蛋白表達(dá).pdf

1、目的: 克隆egG1Y162抗原基因,構(gòu)建PET-41a/egG1Y162原核表達(dá)質(zhì)粒,并誘導(dǎo)表達(dá)egG1Y162重組蛋白及抗原性檢測(cè)。
　　 方法: 根據(jù)emY162基因序列設(shè)計(jì)引物，分別從細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲兩個(gè)發(fā)育階段,提取基因組DNA和總RNA，mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用PCR的方法以基因組DNA和cDNA為模板擴(kuò)增egG1Y162基因；構(gòu)建PUCm-T/egG1Y162重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定后，測(cè)序

2、確定其正確性。利用定向克隆技術(shù)將egG1Y162抗原基因片段克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒PET-41a上，通過酶切分析和PCR 鑒定篩選出陽性克隆,測(cè)序確定序列。IPTG初步誘導(dǎo)和表達(dá)egG1Y162-GST 重組蛋白，通過SDS-PAGE 電泳和Western blot試驗(yàn)分析鑒定。
　　 結(jié)果: 從細(xì)粒棘球絳蟲的兩個(gè)不同發(fā)育階段均克隆出egG1Y162基因，從總DNA克隆得到片段長度1 680bp，從cDNA克隆得到片段長度459bp

3、。相似性比較表明，egG1Y162基因序列與emY162相似性為91%,而egG1Y162基因cDNA與emY162相似性為95%。進(jìn)一步分析顯示，egG1Y162基因序列由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子區(qū)域分別為1～70，1 064～1 380和1 577～1 648。位于疏水端1～16位氨基酸構(gòu)成egG1Y162信號(hào)肽序列，35～115位氨基酸形成一個(gè)大的纖黏連蛋白剪接體FN3,133～152位氨基酸構(gòu)成羧基端跨膜區(qū)域。測(cè)序結(jié)果

4、顯示egG1Y162 抗原基因長度為360 bp，編碼120個(gè)氨基酸。構(gòu)建的PET-41a/egG1Y162原核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE檢測(cè)表明egG1Y162-GST重組蛋白得到成功表達(dá)，在相對(duì)分子量為44 Kda 處有表達(dá)條帶。Western blot分析顯示陽性印跡條帶，分子量為44 Kda，egG1Y162重組蛋白能與細(xì)粒棘球蚴感染40天后犬的血清發(fā)生反應(yīng)；與包蟲病患者血清也有陽性反應(yīng)。
　　 結(jié)論: