細(xì)粒棘球蚴中國大陸株鐵蛋白基因的克隆、重組表達(dá)、純化及免疫學(xué)特性鑒定.pdf

1、目的：擴(kuò)增中國大陸株細(xì)粒棘球蚴(Echinococcus granulosus Eg)鐵蛋白（ferritin）基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并對重組蛋白免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定，為包蟲病分子疫苗的研制提供新的候選基因。 方法： (1)以細(xì)粒棘球蚴原頭蚴的RNA為模板，根據(jù)互聯(lián)網(wǎng)GenBank檢索出的細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因序列設(shè)計引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；(2)將目的基因亞克隆到pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，對重組基

2、因進(jìn)行DNA測序；(3)利用DNAman、NCBI/BLAST公共數(shù)據(jù)庫對目的基因的同源性進(jìn)行比較分析。應(yīng)用DNAstar、Biosun 等生物分析軟件對該鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)、抗原表位、三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；(4)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Ⅰ：a.將目的基因亞克隆于表達(dá)載體pGEX-6P-1，轉(zhuǎn)化入Bl21，誘導(dǎo)融合蛋白(Eg.ferritin/GST)的表達(dá)，經(jīng)親和層析法純化Eg.ferritin/GST；b.用含Eg.ferritin/GS

3、T的凝膠條帶免疫小鼠的抗血清及細(xì)粒棘球蚴免疫家兔的抗血清，通過Western-blot對Eg.ferritin/GST的免疫學(xué)特性進(jìn)行初步研究；(5)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Ⅱ：a.將目的基因亞克隆于pET-28a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)plysS，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白(Eg.ferritin)，經(jīng)含Ni2+的His-bind樹脂柱純化 Eg.ferritin；b.用Eg.ferritin免疫小鼠的抗血清，通過Western-bl

4、ot及ELISA對Eg.ferritin的免疫學(xué)特性進(jìn)行研究。 結(jié)果： (1)PCR得到562bp的目的基因。(2)該基因與互聯(lián)網(wǎng)檢索的基因序列在390bp內(nèi)同源性為97.7％，氨基酸序列在130AA內(nèi)同源性為97.7％。不同生物間的同源性平均達(dá)40.79％。生物軟件預(yù)測：Eg.ferritin的分子量約16.7 kD，非極性氨基酸數(shù)目為68個，預(yù)測抗原表位的肽段為7N-12E,36H -43V, 55S-62H, 69Q-7

5、6R, 82A-89E, 102I-107E, 117A –124S,129L–136T。(3)構(gòu)建了Eg.ferritin/pGEX-6P-1/BL21基因工程菌株，表達(dá)融合蛋白Eg.ferritin/GST，因以包涵體形式存在，無法純化。Western-blot 結(jié)果：Eg.ferritin/GST能被Eg免疫家兔的抗血清和Eg.ferritin/GST凝膠條帶免疫小鼠的抗血清識別，同時小鼠抗血清還可識別天然抗原囊液、原頭蚴中約19

6、kD的條帶。(4)構(gòu)建了Eg.ferritin/pET-28a /BL21(DE3)plysS基因工程菌株，表達(dá)并純化出Eg.ferritin。Western-blot檢測：Eg.ferritin免疫小鼠的抗血清可識別Eg.ferritin、天然抗原（囊液及原頭蚴），其位置大致相同約19kD。ELISA結(jié)果表明：免疫組血清中的IgG值明顯高于對照組血清(P<0.01)。 結(jié)論： (1)成功擴(kuò)增出中國大陸株細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因，

7、構(gòu)建了基因工程菌株Eg.ferritin/ pGEM-T/JM109。(2)鐵蛋白結(jié)構(gòu)功能及抗原表位的預(yù)測對本實(shí)驗的實(shí)施及選取有價值的抗原肽段提供了理論依據(jù)。(3)成功構(gòu)建基因工程菌株Eg.ferritin/pGEX-6P-1/BL21，表達(dá)分子量約42kD的融合蛋白Egferritin/GST，但無法純化。(4)成功構(gòu)建基因工程菌株Eg.ferritin/pET-28a/BL21(DE3) plysS，表達(dá)并純化出分子量約19kD的重