microRNA在變應(yīng)性鼻炎伴-不伴哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用及其遺傳易感性研究.pdf

1、研究背景：變應(yīng)性鼻炎（AR）是一種因接觸過敏原后由以IgE及多種炎性介質(zhì)介導(dǎo)的，發(fā)生于鼻腔黏膜的慢性炎癥性疾病。變應(yīng)性鼻炎已經(jīng)成為一個(gè)全球健康問題，尤其是在工業(yè)化國家中發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)。根據(jù)大量研究顯示，變應(yīng)性鼻炎是哮喘的重要危險(xiǎn)因素，變應(yīng)性鼻炎合并哮喘的發(fā)病率在顯著上升，尤其是在兒童變應(yīng)性鼻炎患兒中，合并哮喘的發(fā)病率更顯著高于成人。據(jù)現(xiàn)有研究顯示，變應(yīng)性鼻炎和哮喘雖然都是過敏性炎癥疾病，但這兩種疾病的易感SNP位點(diǎn)并不完全一致。盡

2、管有大量研究檢測變應(yīng)性鼻炎和哮喘的遺傳易感基因，但對(duì)于兩者疾病共同的基因易感和相關(guān)機(jī)制研究甚少，并且，幾乎沒有學(xué)者對(duì)環(huán)境暴露和基因多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)行探索，現(xiàn)有的研究只為我們提供了非常有限的對(duì)呼吸系統(tǒng)過敏性疾病發(fā)病機(jī)制的理解。
　　MiRNA是最新發(fā)現(xiàn)的一類重要的維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)的并在進(jìn)化中高度保守的單鏈RNA分子，長度約為19-25核苷酸。最近的研究顯示 miRNA在慢性炎癥疾病、過敏性疾病中發(fā)揮重要作用，如哮喘、變應(yīng)性皮炎和變應(yīng)性

3、鼻炎。MiRNA可以通過抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄從而影響基因的表達(dá)，并且可以影響相關(guān)免疫細(xì)胞的成熟、分化和活性。
　　現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)miRNA序列上含有大量與各類疾病相關(guān)的SNP位點(diǎn)，這些研究結(jié)果可能會(huì)讓我們更深入理解 miRNA的生物起源和這些 SNP位點(diǎn)對(duì)人類變異和疾病發(fā)生所造成的影響?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)部分miRNA的SNP位點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生，其中，miR-21、miR-126和miR-155已有研究證明其可能影響Th1/T

4、h2的免疫平衡,但是這些SNP相關(guān)研究極少涉及到基因與環(huán)境的作用機(jī)制。
　　因此，鑒于miRNA中的多個(gè)SNP位點(diǎn)在免疫相關(guān)疾病和自身免疫疾病中的重要作用，本課題第一部分致力于研究多個(gè)相關(guān) miRNA的 SNP位點(diǎn)與中國兒童變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性鼻炎伴哮喘的遺傳易感性；第二部分研究相關(guān)miRNA的SNP位點(diǎn)與中國變應(yīng)性鼻炎的遺傳易感性；第三部分研究前部分所得的陽性SNP位點(diǎn)引起過敏性疾病的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)，進(jìn)一步深入研究在變應(yīng)原環(huán)境暴露

5、中，該SNP位點(diǎn)與變應(yīng)性疾病的作用機(jī)制。
　　第一部分：MicroRNA基因多態(tài)性與中國兒童變應(yīng)性鼻炎伴/不伴哮喘遺傳易感性研究
　　目的：中國兒童變應(yīng)性鼻炎患兒伴發(fā)哮喘的發(fā)病率逐年升高。近期的研究報(bào)導(dǎo)，多種 miRNA的基因多態(tài)性位點(diǎn)在變應(yīng)性鼻炎和哮喘的發(fā)病中起重要作用。本部分旨在討論5個(gè) miRNA（miR-146a, miR196a2, miR-499, miR-149 and miR-585）的SNPs位點(diǎn)與兒童變應(yīng)

6、性鼻炎伴或不伴哮喘的相關(guān)性。
　　方法：我們收集了176例兒童變應(yīng)性鼻炎患兒、124例兒童變應(yīng)性鼻炎伴哮喘患兒及204例健康對(duì)照組兒童的外周血標(biāo)本進(jìn)行研究。提取血液樣本中的DNA，運(yùn)用PCR-RFLP及DNA直接測序法對(duì)樣本中7個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)miR-146a(rs2910164, rs57095329 and rs6864584), miR-196a2(rs11614913), miR-499(rs3746444), miR-14

7、9(rs2292832) and miR-585(rs62376935)進(jìn)行基因分型，并統(tǒng)計(jì)是否存在遺傳易感性。
　　結(jié)果：所有兒童變態(tài)反應(yīng)性鼻炎、變態(tài)反應(yīng)性鼻炎伴哮喘例組及健康對(duì)照組樣本的miRNA基因SNP分型結(jié)果均符合哈迪溫伯格平衡（P＞0.05）。樣本PCR-RFLP實(shí)驗(yàn)結(jié)果和DNA直接測序結(jié)果相吻合。兒童變應(yīng)性鼻炎病例組和變應(yīng)性鼻炎伴哮喘組中miR149的rs2292832位點(diǎn)CC基因型及C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(P

8、＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；更重要的是，在變應(yīng)性鼻炎伴哮喘的患兒組中，CC基因型和 C等位基因頻率也顯著高于變應(yīng)性鼻炎患兒組（P＜0.05）。而其它6個(gè)miRNA基因的SNP頻率在變應(yīng)性鼻炎患兒組、變應(yīng)性鼻炎伴哮喘和健康對(duì)照兒童組中均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：兒童變應(yīng)性鼻炎及變應(yīng)性鼻炎伴哮喘的遺傳易感性與miR149基因多態(tài)性有顯著相關(guān)性；miRNA中miR149的rs2292832位點(diǎn)的基因多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性鼻炎伴哮

9、喘的易感性有關(guān)；在變應(yīng)性鼻炎患兒中，CC基因型的患兒更易感哮喘。
　　第二部分：miRNA單核苷酸多態(tài)與中國人群變應(yīng)性鼻炎遺傳易感性研究
　　目的：課題本部分旨在探討7個(gè)miRNA相關(guān)SNP位點(diǎn)miR-146a(rs2910164, rs57095329 and rs6864584), miR-196a2(rs11614913), miR-499(rs3746444), miR-149(rs2292832) and miR-

10、585(rs62376935)與中國人群中變應(yīng)性鼻炎遺傳易感性的相關(guān)性。
　　方法：我們收集了610例中國變應(yīng)性鼻炎患者及720例中國正常對(duì)照組人群進(jìn)行病例-對(duì)照研究。本研究運(yùn)用PCR-RFLP方法對(duì)所有病例組合對(duì)照組樣本進(jìn)行SNP基因分型，其中20%的樣本運(yùn)用直接測序法進(jìn)行基因檢測以證實(shí)PCR-RFLP實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
　　結(jié)果：相比較于正常對(duì)照組，變應(yīng)性鼻炎病例組中 miR-149的rs2292832 SNP位點(diǎn) CC

11、基因型和 C等位基因頻率顯著增高（P=2.60×10-9, OR2.66;P=4.11×10-11, OR1.70, respectively）。MiR-149是變應(yīng)性鼻炎的遺傳易感基因。
　　結(jié)論：本部分研究結(jié)果證實(shí)miR-149的rs2292832位點(diǎn)基因多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎遺傳易感性顯著相關(guān)。
　　第三部分：變應(yīng)性鼻炎易感基因miRNA-149基因多態(tài)性功能研究
　　目的：本課題前面兩部分研究中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與呼吸系統(tǒng)

12、過敏性疾病顯著相關(guān)的易感基因miR-149 rs2292832，所以我們?cè)谶@部分深入研究miR-149基因在在環(huán)境因素過敏原暴露前后的相關(guān)免疫調(diào)控功能。
　　方法：從健康人群中提取PBMC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，運(yùn)用RT-PCR和ELISA方法，分別檢測HDM刺激前后rs2292832三種基因型的PBMC的miR-149表達(dá)和上清液中IL-4, IL-5, IL-6, IL-17, IL-10和 INF-γ細(xì)胞因子的水平。
　　結(jié)果：

13、本部分研究發(fā)現(xiàn)rs2292832可調(diào)控miR-149表達(dá)水平，CC基因型的 miR-149表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；在 HDM刺激后，miR-149的表達(dá)水平相對(duì)于刺激前顯著下降，IL-4的表達(dá)水平明顯增高，而INF-γ則有顯著的降低。
　　結(jié)論：miR-149基因rs2292832的突變會(huì)影響miR-149的表達(dá)，在過敏原暴露后，miR-149可調(diào)控 Th1、Th2的免疫功能表達(dá)，導(dǎo)致Th1／Th2細(xì)胞失衡，從而引起了過