RNAi沉默CCR3對(duì)變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制影響實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)是由IgE介導(dǎo)發(fā)生在對(duì)變應(yīng)原敏感患者鼻黏膜的炎性疾病,以噴嚏、鼻溢液、鼻充血和鼻癢為主要特征,約60％-70%的患者同時(shí)伴有眼癢、眼紅和/或流淚。盡管沒(méi)有生命危險(xiǎn),但變應(yīng)性鼻炎的癥狀常常令人感到焦慮并可能出現(xiàn)身體和精神方面的并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的工作和生活質(zhì)量,并明顯增加了個(gè)人和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。流行病學(xué)研究表明變應(yīng)性鼻炎發(fā)病不斷增加,目前影響約40%的世界人口,近年

2、的研究發(fā)現(xiàn)其不僅是局部疾病也是全身性疾病,特別是與整個(gè)呼吸道疾病密切相關(guān)。上氣道變應(yīng)原刺激不僅導(dǎo)致鼻腔局部的炎癥反應(yīng),也導(dǎo)致了下氣道的炎癥反應(yīng),由于“一個(gè)氣道、一種疾病”,變應(yīng)性鼻炎和哮喘常常共存。研究表明:20%-50%的變應(yīng)性鼻炎的病人有臨床哮喘存在,而>80%的變應(yīng)性哮喘的患者伴隨鼻炎的癥狀。由于上下呼吸道在生理學(xué)、功能和免疫學(xué)方面緊密相連,變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病對(duì)哮喘的發(fā)病及病理過(guò)程亦產(chǎn)生很大的影響,并且使的整個(gè)呼吸道疾病遷延不愈,因

3、此已經(jīng)變成嚴(yán)重影響公眾健康的疾病。近年來(lái),雖然AR已引起廣泛的關(guān)注及研究,但由于多樣的影響因素及復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,目前的治療效果尚不完全令人滿意,迫切需要進(jìn)行更深入的研究及尋找新的治療方法。
　　嗜酸性細(xì)胞(Eosinophils,EOS)是多功能白細(xì)胞,在Th2調(diào)節(jié)的變應(yīng)性疾病中起著主要作用,是變應(yīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制中的研究重點(diǎn)。此類變應(yīng)性疾病的一個(gè)重是要特征組織內(nèi)EOS大量浸潤(rùn)。嗜酸性細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)局部免疫和炎癥反應(yīng),激活的嗜酸性細(xì)

4、胞從血液到組織中募集,可以導(dǎo)致包括細(xì)胞因子、趨化因子、脂質(zhì)介質(zhì)和細(xì)胞毒性顆粒蛋白的釋放,這些因子可以觸發(fā)和維持局部靶組織的炎癥和重塑,在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)和炎癥的發(fā)生中起著重要作用。
　　趨化因子受體3(CCR3)是主要在EOS上表達(dá)的跨膜生成的G蛋白偶聯(lián)受體,通過(guò)與嗜酸細(xì)胞活化趨化因子(Eotaxin)結(jié)合而激活G蛋白依賴的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通道而使嗜酸性細(xì)胞祖細(xì)胞和成熟嗜酸性細(xì)胞由骨髓中釋放并誘導(dǎo)他們遷移進(jìn)入特定變態(tài)反應(yīng)性炎癥組織,而此類結(jié)

5、合同時(shí)產(chǎn)生下游信號(hào)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)并導(dǎo)致炎癥細(xì)胞脫顆粒。因此,CCR3在募集EOS到炎癥組織過(guò)程中起著重要作用。
　　RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由外源雙鏈RNA(dsRNA)植入細(xì)胞引發(fā)的一種高效基因表達(dá)抑制途徑,是一個(gè)保守的內(nèi)源性的活動(dòng)能夠用于基因組功能方面的研究。運(yùn)用RNAi,特異性的基因片段被植入細(xì)胞,通過(guò)特異性序列的降解和mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程翻譯的干擾,觸發(fā)基因功能的減退而產(chǎn)生基因沉默的作用。RN

6、Ai被發(fā)現(xiàn)以來(lái)已顯示出巨大的潛力并獲得了廣泛的應(yīng)用,與傳統(tǒng)藥物比較,運(yùn)用RNAi治療方法能夠抑制各種級(jí)別的靶基因的表達(dá),具有高選擇性及優(yōu)勢(shì),提供個(gè)性化的治療,容易合成,并能夠快速識(shí)別及優(yōu)化,RNAi正快速成為一種分析真核生物基因功能及通過(guò)基因沉默治療疾病的充滿希望的方法。目前,一些體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)對(duì)許多疾病運(yùn)用RNAi治療是有效的。而在呼吸道疾病的應(yīng)用中也已進(jìn)行了一些研究,盡管運(yùn)用siRNAs治療呼吸道疾病的給藥方式有多種途徑,

7、但主要集中在通過(guò)支氣管或鼻腔內(nèi)給藥。這種直接給藥的途徑需較低劑量的siRNAs,減少了不良的全身副作用,由于氣道內(nèi)核酸酶活性較低因而提高了siRNA的穩(wěn)定性,針對(duì)呼吸道疾病更有效。而鼻腔途徑更有優(yōu)勢(shì),這在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)。
　　嗜酸性粒細(xì)胞在鼻黏膜中大量浸潤(rùn)是變應(yīng)性鼻炎的重要病理學(xué)特征。目前的研究亦認(rèn)為這同時(shí)是變應(yīng)性鼻炎的一個(gè)重要發(fā)病環(huán)節(jié),因此,治療變應(yīng)性鼻炎疾病過(guò)程的重要方面即抑制嗜酸性粒細(xì)胞局部浸潤(rùn)和活化,這將有助于對(duì)

8、變應(yīng)性疾病發(fā)病的控制。
　　當(dāng)前,運(yùn)用RNAi沉默CCR3對(duì)變應(yīng)性鼻炎嗜酸性細(xì)胞作用過(guò)程全程(從骨髓嗜酸性祖細(xì)胞的募集、遷移到嗜酸性細(xì)胞的凋亡)影響進(jìn)行研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道,而運(yùn)用RNAi沉默CCR3對(duì)變應(yīng)性鼻炎的治療效果的研究目前國(guó)內(nèi)外尚不多見(jiàn)。
　　因此,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?jīng)鼻腔運(yùn)用RNAi沉默CCR3在嗜酸性細(xì)胞上的表達(dá),通過(guò)阻斷Eotaxin/CCR3路徑的作用分析、了解并觀察其對(duì)嗜酸性細(xì)胞凋亡過(guò)程的影響及嗜酸

9、性細(xì)胞在骨髓、外周血及局部組織的募集、遷移及成熟過(guò)程的機(jī)制變化,以期全面了解變應(yīng)性鼻炎嗜酸性細(xì)胞在此干擾過(guò)程中的變化及影響,為變應(yīng)性鼻炎的基因治療尋找新的靶點(diǎn)及方法。
　　第一部分L小鼠CCR3RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的:
　　構(gòu)建小鼠CCR3基因RNA干擾慢病毒表達(dá)載體,并評(píng)估其對(duì)嗜酸性細(xì)胞CCR3沉默作用。
　　方法:
　　針對(duì)小鼠CCR3基因序列,設(shè)計(jì)出RNAi靶點(diǎn)序列,同時(shí)合成靶序列的

10、Oligo DNA,經(jīng)退火處理后形成雙鏈DNA,再與由MluI、SacⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切后形成的pLVX-shRNA2-m載體連接產(chǎn)生短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒載體。以shRNA慢病毒載體進(jìn)行293T細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞轉(zhuǎn)染后測(cè)定病毒滴度,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)檢測(cè)嗜酸粒細(xì)胞中CCR3mRNA的表達(dá)情況和蛋白印跡法(western blot)檢測(cè)CC

11、R3的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　shRNA-mCCR3慢病毒載體成功進(jìn)行構(gòu)建,并與設(shè)計(jì)合成的靶向鏈測(cè)序完全一致。利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞的感染效率>90%,而病毒滴度的檢測(cè)結(jié)果為4X108TU/ml;運(yùn)用Q-PCR及western blot檢測(cè)結(jié)果顯示嗜酸性細(xì)胞CCR3基因沉默效率達(dá)到86.7%而CCR3的蛋白表達(dá)明顯減低。
　　結(jié)論:
　　CCR3基因RNAi慢病毒表達(dá)載體被成功構(gòu)建,而且有

12、較高的嗜酸性細(xì)胞CCR3基因沉默效率,為后續(xù)通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解其對(duì)EOS的影響及在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分:慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默CCR3對(duì)變應(yīng)性鼻炎嗜酸性細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　運(yùn)用經(jīng)體外合成的以慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi經(jīng)鼻腔沉默CCR3基因表達(dá),觀察變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻腔黏膜病理變化及在骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中嗜酸性細(xì)胞比例變化。觀察變應(yīng)性鼻炎小鼠在骨髓、外周血及鼻腔

13、灌洗液(鼻黏膜)中嗜酸性細(xì)胞CCR3基因mRNA及蛋白的表達(dá)變化、嗜酸性細(xì)胞顆粒蛋白變化。觀察在體外培養(yǎng)嗜酸性細(xì)胞感染合成的慢病毒載體后對(duì)EOS凋亡的影響。進(jìn)而評(píng)價(jià)其對(duì)變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機(jī)制的影響并評(píng)估該基因治療方法在變應(yīng)性鼻炎中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　將CCR3siRNA重組穿梭質(zhì)粒(pLVX-ShRNA2-mCCR3-1+2+3+4)經(jīng)鼻腔局部給藥方法應(yīng)用于小鼠過(guò)敏性鼻炎動(dòng)物模型上,經(jīng)HE染色、瑞氏染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠鼻黏

14、膜病理變化及骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞比例的改變。以逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞CCR3及顆粒蛋白mRNA的表達(dá)變化。Western blot檢測(cè)骨髓、外周血及鼻腔粘膜CCR3基因蛋白表達(dá)變化。TUNEL檢測(cè)體外培養(yǎng)嗜酸性細(xì)胞凋亡在CCR3基因靶向干擾下的變化。
　　結(jié)果:
　　(1):HE染色顯微鏡觀察變應(yīng)性性鼻炎小鼠鼻黏膜水腫、上皮脫落、黏膜下血管擴(kuò)

15、張,并可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),與正常對(duì)照組相比較嗜酸性粒細(xì)胞明顯多,經(jīng)CCR3siRNA治療后,可見(jiàn)鼻腔黏膜水腫減輕、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
　　(2):瑞氏染色觀察,計(jì)數(shù)顯示血液、骨髓、鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞比例均比正常對(duì)照組高,經(jīng)CCR3siRNA治療后,嗜酸性粒細(xì)胞比例下降。
　　(3):CCR3siRNA治療組CCR3mRNA在骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中表達(dá)低于PBS治療對(duì)照及siRNA治療對(duì)照組(P<0.05

16、)。
　　(4):CCR3siRNA治療組的嗜酸性粒細(xì)胞顆粒蛋白:主要堿性蛋白(MBP)、陽(yáng)離子蛋白(ECP)及過(guò)氧化物酶(EPO)的mRNA在骨髓、外周血、鼻腔灌洗液中表達(dá)均低于PBS治療對(duì)照及siRNA治療對(duì)照組(P<0.05)。
　　(5):在實(shí)驗(yàn)小鼠骨髓、外周血、鼻腔黏膜中,CCR3siRNA治療組的CCR3基因蛋白表達(dá)低于PBS治療對(duì)照及siRNA治療對(duì)照組(P<0.05)。
　　(6):TUNEL檢測(cè)結(jié)果表

17、明,與對(duì)照組相比較,嗜酸性粒細(xì)胞感染shRNA-mCCR3慢病毒顆粒后其凋亡率增加。
　　結(jié)論:
　　(1)經(jīng)鼻腔進(jìn)行針對(duì)CCR3基因RNAi技術(shù)的靶向治療可減輕變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型中鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)過(guò)程并減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量。
　　(2)經(jīng)鼻腔進(jìn)行針對(duì)CCR3基因RNAi技術(shù)的靶向治療可抑制變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型中嗜酸性粒細(xì)胞的發(fā)育、遷移及浸潤(rùn)過(guò)程,減少嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒作用而減輕變應(yīng)性鼻炎