捻轉(zhuǎn)血矛線蟲熱休克蛋白70和過氧化氫酶生物學(xué)特性研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是羊牛等反芻動物常見寄生蟲，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。隨著捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等工作的開展，尋找新型有效的防控措施成為可能。本實(shí)驗(yàn)室已對自由生活階段的幼蟲進(jìn)行了比較蛋白組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70(Heat shock protein70，Hsp70)在第三期幼蟲(L3)活化后上調(diào)表達(dá)，而過氧化氫酶(catalase)表達(dá)量顯著減少。為探索這兩個(gè)差異性表達(dá)蛋白在蟲體侵入宿主過程中的作用，本文對其基因進(jìn)行了

2、克隆和原核表達(dá)，并對其部分生物學(xué)特性進(jìn)行了分析。
　　1Hsp70基因的克隆、原核表達(dá)及生物學(xué)特性分析
　　根據(jù)GenBank中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hsp70序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物，克隆了該基因，測序正確后將其亞克隆至pET28a(+)載體。原核表達(dá)載體pET28a-Hsp70轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后用IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳顯示該基因成功表達(dá)，融合蛋白分子量約為75KD。Western blot結(jié)果顯示該重組蛋白可被人工

3、感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲山羊血清所識別。用免疫熒光技術(shù)檢測出該重組蛋白可與山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)結(jié)合。該重組蛋白可以增強(qiáng)山羊PBMC分泌NO的能力。以重組蛋白抗大鼠血清為一抗，以含Cy3標(biāo)記的山羊抗大鼠抗體作為二抗，對Hsp70在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌、雄蟲中的分布進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該蛋白在雌雄蟲的腸道、肌肉和皮下組織中均有分布。
　　2過氧化氫酶的基因克隆、原核表達(dá)及生物學(xué)特性分析
　　用RT-PCR技術(shù)獲得了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ca

4、talase基因，將測序正確的catalase基因片段克隆到pET28a(+)載體上，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-catalase并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳顯該基因成功表達(dá)，融合蛋白分子量大小與預(yù)期一致。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該重組蛋白具有酶活性，且在37℃下活性最高。Western blot結(jié)果顯示重組蛋白可被人工感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲山羊血清所識別。免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明該重組蛋白可與山羊PBMC相結(jié)

5、合。重組catalase蛋白在體外可以促進(jìn)山羊PBMC分泌NO。以重組catalase抗大鼠血清為一抗，以含Cy3標(biāo)記的山羊抗大鼠抗體作為二抗，對catalase在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌、雄蟲中的分布進(jìn)行分析，結(jié)果顯示catalase在雌雄蟲的腸道、肌肉和皮下組織中廣泛分布。
　　3應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制活化第3期幼蟲Hsp70基因的轉(zhuǎn)錄
　　針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hsp70基因設(shè)計(jì)并合成了3對siRNA(S1-S3)和一對無關(guān)干擾RNA