豬脂肪沉積三個(gè)候選基因的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本文主要在分子和細(xì)胞水平上研究了豬脂肪沉積代謝相關(guān)的三個(gè)候選基因。脂肪甘油三酯脂酶(AdiposeTriglycerideLipase,ATGL)是2004年由幾個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室采用不同的方法相繼發(fā)現(xiàn)的一種新的甘油三酯水解酶,官方命名為PNPLA2,又名為iPLA2ζ,desnutrin,TTS2.2和PEDF-R等。該酶主要水解甘油三酯(TG)的第一酯鍵產(chǎn)生甘油二酯(DAG),然后激素敏感脂肪酶(HSL)降解甘油二酯為游離脂肪酸(FFA

2、)。因此,ATGL與HSL一起協(xié)同消耗哺乳動(dòng)物體內(nèi)儲(chǔ)存的脂肪。脂聯(lián)素(Adiponectin,Acrp30)首次發(fā)現(xiàn)于1995年,現(xiàn)在研究證明它是機(jī)體的脂質(zhì)代謝和血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子。Adiponectin由脂肪細(xì)胞分泌后進(jìn)入血液,以多種形式在血液中循環(huán)。脂聯(lián)素球狀區(qū)在體內(nèi)獨(dú)立存在,與完整的脂聯(lián)素功能相似。脂聯(lián)素能夠促進(jìn)肌肉脂肪酸氧化、降低血漿甘油三酯、通過增強(qiáng)胰島素的敏感性而促進(jìn)葡萄糖代謝。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人脂聯(lián)素基因的多態(tài)

3、性與肥胖、胰島素敏感性和2型糖尿病有關(guān)。抵抗素(Resistin,RSTN)首次發(fā)現(xiàn)于2001年,是一種典型的脂肪細(xì)胞因子。Resistin的重要生理作用就是將肥胖與胰島素抵抗聯(lián)系起來,其進(jìn)一步深入研究對(duì)于預(yù)防、檢測(cè)和治療2型糖尿病具有重要指導(dǎo)意義。
　　 鑒于ATGL在脂質(zhì)代謝和脂肪沉積中的重要作用,我們針對(duì)豬ATGL基因開展了對(duì)分子水平上的研究,包括全長(zhǎng)cDNA和DNA的分離、mRNA組織表達(dá)譜分析、多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)與遺傳效

4、應(yīng)分析、啟動(dòng)子活性分析、融合蛋白表達(dá)定位及轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆篩選等。同時(shí),我們還選取豬脂聯(lián)素和抵抗素基因?yàn)橹境练e和胴體性狀的重要候選基因,重點(diǎn)開展了序列分離和有效分子標(biāo)記鑒定的工作。關(guān)于豬ATGL、Acrp30和RSTN基因的研究,初步的結(jié)果如下:
　　 1.豬ATGL基因
　　 (1)全長(zhǎng)cDNA的克隆與鑒定。結(jié)合EST序列拼接和cDNA末端快速擴(kuò)增的方法,獲得了豬ATGL基因的全長(zhǎng)cDNA序列。發(fā)現(xiàn)豬ATGL基因編碼區(qū)為

5、1461bp,編碼486個(gè)氨基酸(aa),分子量大小為53.2kDa,等電點(diǎn)為7.90。與其它物種一樣,豬ATGL蛋白N端預(yù)測(cè)含patatin脂肪酶結(jié)構(gòu)域,同時(shí)含絲氨酸酯酶的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)和催化二元組基序(GXSXG和DXG/A),對(duì)應(yīng)的活性殘基為Ser47和Asp166;物種間同源性比較發(fā)現(xiàn)豬ATGL與牛、狗、小鼠、大鼠、人同源性較高(＞83％)且遺傳進(jìn)化關(guān)系距牛最近。
　　 (2)全長(zhǎng)基因組DNA的分離與鑒定。結(jié)合染色

6、體步移獲得豬ATGL基因全長(zhǎng)基因組DNA序列7044bp。結(jié)合物種間同源比較發(fā)現(xiàn)該基因含9個(gè)編碼外顯子,且所有的內(nèi)含子和外顯子的拼接都符合GT/AG規(guī)則。
　　 (3)啟動(dòng)子序列的獲得及生物信息學(xué)分析。利用基因組步移法擴(kuò)增得到豬ATGL基因5’側(cè)翼998bp的序列。利用NNPP、MotifFinder、TFSEARCH、CPGPLOT、SignalScan等軟件對(duì)該基因的核心啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、CpG島的分布以及與啟動(dòng)子相結(jié)合

7、的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析,發(fā)現(xiàn)翻譯起始密碼子ATG上游164bp處為轉(zhuǎn)錄起始,204bp到155bp之間存在核心啟動(dòng)子,同時(shí)預(yù)測(cè)到含有帽子信號(hào)、TATA框、GC盒、CAAT和GATAs等順式元件和CREBP1、MyoD、C/EBP等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。另外,在ATGL基因的上游調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)2處突變。
　　 (4)染色體精細(xì)定位。利用豬-倉(cāng)鼠輻射雜交克隆板定位(IMpRH)成功將豬ATGL基因定位于SSC2p17(LOD=10.26

8、),即SSC2p末端,而該區(qū)剛好存在一個(gè)影響背膘厚的QTL。
　　 (5)多態(tài)位點(diǎn)的掃描。以瘦肉型豬種(大約克夏、長(zhǎng)白、杜洛克豬等)和脂肪型中國(guó)地方豬種(梅山豬等)為研究材料,掃描ATGL基因在不同豬種的序列遺傳變異,發(fā)現(xiàn)了編碼區(qū)序列存在11處單核苷酸變異。
　　 (6)G392A突變的遺傳效應(yīng)分析。發(fā)現(xiàn)patation保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)第392位核苷酸G/A突變(G392A),導(dǎo)致第131位的Arg/His變異(R131H)

9、。通過建立一種快速靈敏的引物突變和PCR-RFLP法在不同群體中對(duì)該位點(diǎn)的等位基因頻率分布進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在大白和長(zhǎng)白豬中A等位基因占優(yōu)勢(shì),頻率分別為73％和80％；而脂肪型梅山豬中G等位基因占優(yōu)勢(shì)(73％)。遺傳效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與幾乎所有的脂肪相關(guān)檢測(cè)性狀都極顯著或顯著相關(guān),包括皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪相關(guān)性狀、瘦肉率、眼肌性狀、肋骨數(shù)等。根據(jù)TOPpred軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),該突變可能位于鄰近第三跨膜區(qū)(141-161aa)的膜內(nèi)區(qū)(64

10、-140aa)；而且該突變又是位于patation功能域內(nèi),所以R131H突變極有能對(duì)ATGL的空間結(jié)構(gòu)或激活水平產(chǎn)生影響。
　　 (7)組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。利用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)進(jìn)行ATGL基因mRNA表達(dá)譜分析,發(fā)現(xiàn)皮下脂肪組織中超高量特異表達(dá),肌肉、小腸和心臟中等表達(dá),而在肝、脾、肺、胃、腎和卵巢中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。
　　 (8)啟動(dòng)子活性分析。構(gòu)建了7個(gè)含豬ATGL基因翻譯起始上游序列的不同缺失片段的熒光素

11、酶報(bào)告基因表達(dá)載體,分別為pGL3-Q1(-998bp～+45bp)、pGL3-Q2(-788bp～+45bp)、pGL3-Q3(-631bp～+45bp)、pGL3-Q4(-568bp～+45bp)、pGL3-Q5(-472bp～+45bp)、pGL3-Q6(-367bp～+45bp)和pGL3-Q7(-198bp～+45bp),用Lioofectamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞株,48小時(shí)后雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在生物發(fā)

12、光儀中檢測(cè)。結(jié)果分析表明,最小核心啟動(dòng)子區(qū)于-367bp～-164bp處,-568b～-367bp存在正調(diào)控元件,-788bp～-568bp存在負(fù)調(diào)控元件。
　　 (9)融合蛋白表達(dá)。構(gòu)建了不同缺失蛋白的EGFP融合表達(dá)載體pATGL/EGFP、pATGL-pat/EGFP、pATGL-Npat/EGFP、pATGL-Fab/EGFP和pHSL/EGFP,轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞系IBRS-2和豬原代脂肪細(xì)胞,并對(duì)轉(zhuǎn)染后蛋白的表達(dá)在激光共聚

13、焦顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)只有完整的HSL和ATGL蛋白才定位于細(xì)胞質(zhì),而其他三個(gè)ATGL缺失蛋白與EGFP融合表達(dá)的產(chǎn)物彌散分布于整個(gè)細(xì)胞中。
　　 (10)G418篩選細(xì)胞克隆。確定本實(shí)驗(yàn)室IBRS-2細(xì)胞的最佳G418篩選濃度為800μg/mL。經(jīng)G418篩選和有限稀釋法反復(fù)篩選成功獲得綠色熒光蛋白分別與ATGL和HSL融合表達(dá)的IBRS-2細(xì)胞克隆(pATGL/EGFP、pHSL/EGFP),能在體外連續(xù)傳代過程中持續(xù)表達(dá)綠色

14、熒光。
　　 2.關(guān)于豬Acrp30的分子標(biāo)記篩選
　　 (1)外顯子2的178bp處存在A/G變異。該位點(diǎn)引起異亮氨酸(Isoleucine)和纈氨酸(Valine)的變異,并引起內(nèi)切酶AcyⅠ的酶切多態(tài)性。利用AcyⅠPCR-RFLP的方法,對(duì)五個(gè)品種豬(國(guó)外品種大白、長(zhǎng)白和杜洛克豬,國(guó)內(nèi)品種梅山和清平豬)進(jìn)行了基因型分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)品種脂肪型豬中A等位基因占絕大多數(shù),而檢測(cè)的國(guó)外純種瘦肉型豬中全都是B等位基因。為

15、檢測(cè)該多態(tài)性與脂肪相關(guān)性狀值間的關(guān)系,在267頭“大白×梅山”F2資源群體中進(jìn)行與胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與眾多脂肪沉積和胴體性狀顯著相關(guān)。G等位基因頻率的增加,有利于增加眼肌面積、瘦肉率和骨率,減少肩部最厚處背膘厚、6-7腰椎背膘厚、胸腰椎間背膘厚和臀部背膘厚等。A178G(Ile60Val)的變異位于豬脂聯(lián)素膠狀區(qū)的第60位氨基酸,可能影響到其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成,進(jìn)而影響到翻譯后修飾和多聚體的生物學(xué)活性。豬脂聯(lián)素基因該功

16、能性位點(diǎn)的首次發(fā)現(xiàn)為該基因作為脂肪沉積相關(guān)性狀重要候選基因進(jìn)一步提供了依據(jù)。
　　 (2)內(nèi)含子2中第958位的A/G突變。用PCR-SSCP檢測(cè)了三個(gè)品種豬的基因型分布,發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的國(guó)內(nèi)品種梅山豬中都為G等位基因,而國(guó)外品種大白和長(zhǎng)白豬中都為A等位基因。在273頭“大白×梅山”F2資源家系群體中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明,A等位基因有利于增加眼肌寬、眼肌面積和瘦肉率,并減少肩部背膘厚、6-7腰椎間背膘厚和平均背膘厚。
　　 3.關(guān)

17、于抵抗素的分子標(biāo)記篩選
　　 發(fā)現(xiàn)318-331bp處的14bp插入/缺失突變,設(shè)計(jì)引物在大白、長(zhǎng)白和梅山等純種和大梅F2群體中擴(kuò)增出含該位點(diǎn)的482/468bp的PCR產(chǎn)物,并通過非變性8％聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)該位點(diǎn)多態(tài)性的分布進(jìn)行分析。絕大部分都為缺失純合型(AA)和雜合型(AG),插入突變占少數(shù)。其中,國(guó)外品種大白和長(zhǎng)白都為缺失純合型(AA),國(guó)內(nèi)品種梅山有三種基因型。在127頭“大白×梅山”F2資源群體中進(jìn)行與胴體性狀的