臺(tái)灣華人法布里病分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、前言：
　　 法布里病(Fabrydisease,FD,OMIM301500)是一種X連鎖遺傳疾病,因X染色體上編碼α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase,α-GalA)基因(GLA,OMIM300644)突變,溶酶體內(nèi)缺乏α-GalA活性,導(dǎo)致神經(jīng)酞胺三聚己糖苷(globotriaoslyceramide,Ob3)為主的大量代謝物無(wú)法分解,堆積于細(xì)胞內(nèi),造成多器官系統(tǒng)損害的綜合征。臨床表現(xiàn)分為典型FD及非典型FD二類(lèi)

2、,典型FD以彌漫性角化性血管瘤、少汗,陣發(fā)性外周神經(jīng)痛等癥狀為主,常在幼年發(fā)病;非典型FD則分為心臟、腎臟和神經(jīng)三個(gè)變異型,常在中年后才發(fā)病,其中FD心臟變異型(Fabrydiseaseatypicalcardiacvariant)臨床表現(xiàn)為肥厚性心肌病,尤其是左心室肥厚,多數(shù)患者攜帶IVS4+919G＞A基因突變(FD心臟變異型基因突變)。
　　 本研究通過(guò)測(cè)定新生兒干燥血點(diǎn)(driedbloodspot,DBS)α-GalA

3、酶活性值結(jié)合后續(xù)GLA基因測(cè)序確定方法來(lái)進(jìn)行新生兒FD及可疑FD家族成員篩檢工作。此外,我們還對(duì)原診斷為特發(fā)性肥厚型心肌病(idiopathichypertrophiccardiomyopanly,IHCM)的患者進(jìn)行了WS4+919G＞A基因突變檢測(cè)。
　　 由于女性雜合子或WS4+919G＞A基因突變攜帶者的α-GalA酶活性減低不明顯,臨床癥狀輕微,因此采用測(cè)定α-GalA酶值方法往往不足以篩查此類(lèi)人群。由此,本研究首次采

4、用了高分辨熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)(highresolutionmeltinganalysis,FIRM)取代傳統(tǒng)α-GalA酶值測(cè)定方法篩查女性雜合子或IVS4+919G＞A基因突變攜帶者,以探索其在篩查此類(lèi)人群中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 對(duì)于FD基因突變攜帶者,是否該啟動(dòng)早期治療目前尚有爭(zhēng)議。以往認(rèn)為Gb3與疾病進(jìn)展和病情嚴(yán)重程度相關(guān),但后來(lái)研究發(fā)現(xiàn),FD患者,FD半合子或雜合子臨床癥狀和血漿或尿液中Gb3含量無(wú)絕對(duì)平行關(guān)系,而與血漿或尿

5、液中鞘氨醇三聚己糖苷(globotriaosylsphingosine,lysoGb3)含量呈正相關(guān)。由此,本論文通過(guò)檢測(cè)FD典型及心臟病變異型患者病情進(jìn)展中及治療前后血漿lysoGb3和Gb3水平,發(fā)現(xiàn)lysoGb3比Gb3更有臨床相關(guān)性,提示血漿lysoGb3水平可用于指導(dǎo)酶補(bǔ)充療法(enzymereplacementtherapy,ERT)的啟動(dòng)時(shí)機(jī)。
　　 研究對(duì)象和方法：
　　 一、研究對(duì)象
　　 (一

6、)新生兒篩查、FD新生兒家族成員及門(mén)診mCM病患檢查
　　 1、臺(tái)灣自2008年1月至2011年6月出生的352,581名新生兒,男184,045名,女168,536名。
　　 2、FD新生兒家族中家庭成員經(jīng)篩查后,具任一種基因突變攜帶者或FD患者共253位,男54位,女199位。
　　 3、心臟內(nèi)科門(mén)診288位診斷為IHCM患者,男198位,女90位。
　　 (二)高分辨熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)(HRM)進(jìn)行G

7、LA基因突變檢測(cè)
　　 由上述(一)研究篩選出的140位確診為FD新生兒(男121位,女19位),進(jìn)行HRM分析。13位正常人作為對(duì)照。
　　 (三)血漿lysoGb3和Gb3檢測(cè)
　　 153位成年FD突變基因攜帶者,包括IVS4+919G＞A突變攜帶者92人(包括典型臨床癥狀男性18位,前期臨床癥狀男性27位,臨床癥狀女性16位和前期臨床癥狀女性31位),20位典型FD基因突變攜帶者(男性8位,女性12位)和

8、41位新型基因突變攜帶者(男性19位,女性22位)。33位正常人作為對(duì)照。
　　 二、研究方法
　　 (一)新生兒篩查、FD新生兒家族成員及門(mén)診mCM病患檢查
　　 1、新生兒篩查:下列(1)～(4),共4項(xiàng)檢查
　　 2、FD確診新生兒的家族成員檢查:下列(2)～(8),共7項(xiàng)檢查。
　　 3、門(mén)診中IHCM病人檢查:下列(2)～(8),共7項(xiàng)檢查。
　　 (1)DBS雙步驟檢測(cè)。

9、>　　 (2)α-GalA酶測(cè)定。
　　 (3)IVS4+919G＞A突變基因檢查。
　　 (4)GL4基因測(cè)序。
　　 (5)心臟科超聲,心電圖檢查。
　　 (6)腎臟科尿蛋白及肌酸酐檢查。
　　 (7)眼科檢查。
　　 (8)皮膚科檢查。
　　 (二)HRM進(jìn)行GLA異常基因檢測(cè)
　　 1、自DBS中,提取DNA。
　　 2、使用RocheLightCycle

10、r480system(Roche,YSA)分出1st外顯子～7th外顯子及IVS4的異常曲線(xiàn)。
　　 (三)血漿lysoGb3和Gb3檢測(cè)
　　 1、以高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜儀,測(cè)量lysoGb3和Gb3。
　　 2、統(tǒng)計(jì)方法:兩組間差異使用學(xué)生t-檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。相關(guān)關(guān)系則以斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)測(cè)試。當(dāng)p值＜0.05時(shí),認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、新生兒篩查結(jié)果
　　 1、

11、經(jīng)DBS雙陽(yáng)性及GLA突變基因檢測(cè),共140位新生兒確診為FD新生兒(占1/2,518)。其中男121人(占1/1,521),女19人(占1/8,870)。
　　 2、確診FD新生兒中,帶IVS4+919G＞A突變基因共113人(81%,113/140);帶典型突變基因共6種,計(jì)6人(4.3%);帶非典型突變基因共3種,計(jì)4人(2.90,6);帶新型突變基因共9種,計(jì)17人(12.1%)。
　　 二、FD新生兒陽(yáng)性家族成

12、員檢查
　　 共253位家族成員確診為FD患者或帶任一種突變基因之?dāng)y帶者,其中帶IVS4+919G＞A突變基因者,共209人(82%);帶典型突變基因共6種,計(jì)12人(4.7%);帶非典型突變基因共3種,計(jì)8入(3.1%);帶新型突變基因共9種,計(jì)24人(9.5%)。
　　 三、心臟科門(mén)診中IHCM結(jié)果
　　 1、288位IHCM患者,其中55位經(jīng)確診為FD患者。其中帶IVS4+919G＞A突變基因者,計(jì)32人(

13、58%);帶典型突變基因共4種,計(jì)19人(34.6%);帶非典型突變基因1種,計(jì)4人(7.3%)。
　　 2、病理學(xué)上變化:心肌細(xì)胞排列紊亂;細(xì)胞肥大;核內(nèi)有大空泡;間質(zhì)纖維化等。
　　 四、HRM進(jìn)行GLA突變基因檢測(cè)
　　 1、引物設(shè)計(jì),包括外顯子7-1、7-2及IVS4-1,分別涵蓋舊的外顯子7及IVS4+919G＞A,該方案可將雜合子及半合子FD病人,在HRM上清楚地分開(kāi)。
　　 2、自DBS中抽

14、出的DNA濃度均在6ng/μl左右,滿(mǎn)足HRM分析所需。故如應(yīng)用HRM篩查,即可免除傳統(tǒng)PCR前須定量DNA的耗時(shí)問(wèn)題,相對(duì)可快速大量篩查檢體。
　　 五、血漿lysoGb3和Gb3檢測(cè)
　　 1、男、女IVS4+919G＞A組與對(duì)照組相較,lysoGb3較高,兩者有明顯差異。
　　 2、男、女IVS4+919G＞A組與典型突變組相較,lysoGb3較低,兩者有明顯差異。
　　 3、男、女性典型突變組相較

15、,lysoGb3較高,兩者有明顯差異。
　　 4、男性典型突變組和對(duì)照組間相較,lysoGb3較高,兩者有明顯差異。
　　 5、男、女IVS4+919G＞A組和男、女對(duì)照組相較,Gb3濃度無(wú)顯著差異。
　　 6、當(dāng)男性或女性FD患者年齡逐漸增加時(shí),lysoGb3亦逐步升高。
　　 7、心臟變異型FD患者,lysoGb3值在臨床癥狀出現(xiàn)前即已升高。
　　 8、心臟變異型FD男、女患者的左心室質(zhì)量指數(shù)

16、與lysoGb3濃度有線(xiàn)性關(guān)連。當(dāng)男、女患者lysoGb3分別大于8.0nM與3.0nM時(shí),都早已有肥厚型心肌病變。
　　 9、15位接受ERT患者,治療后的lysoGb3,均較治療前有明顯下降趨勢(shì)。
　　 10、6種新突變基因(R356Q,G360C,K391T,G104V,A108T,1232T)的患者及基因突變攜帶者,lysoGb3都明顯升高(＞0.8nM)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本論文共收集3

17、53,581名新生兒,涵蓋全臺(tái)灣55%的新生兒。
　　 2、確診為FD男性新生兒比例高達(dá)1/1,520。
　　 3、所有FD新生兒,帶IVS4+919G＞A比例高達(dá)8l%,從而遲發(fā)性心臟變異型FD男性新生兒高達(dá)1/1,880(1/1,520×81%)。
　　 4、HRM是一項(xiàng)可快速篩選FD隱性女性基因突變攜帶者的靈敏方法。
　　 5、使用HRM,無(wú)須于PCR前先定量DNA濃度,可縮短檢測(cè)時(shí)間,大量篩查。<