雞柔嫩艾美耳球蟲多表位亞單位疫苗的構建與免疫保護效果的評價.pdf

1、雞球蟲病是由雞艾美爾球蟲寄生于雞腸上皮細胞內(nèi)引起的原蟲病，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失據(jù)，估計全世界每年直接和間接經(jīng)濟損失約有10-30多億美元，中國約30多億人民幣。藥物預防是目前防控雞球蟲病的主要措施，隨著蟲株耐藥和立法限制抗球蟲藥物，人們更加重視免疫預防。雖然商品化活疫苗具有較好免疫保護效果，但是由于活疫苗存在使用不當易爆發(fā)球蟲感染等安全問題以及較高的生產(chǎn)成本，以亞單位為基礎的新型分子疫苗成為研究者們近年研究的熱點。
　　具有

2、較好免疫原性的抗原是構建以亞單位為基礎的新型分子疫苗的關鍵。通過研究雞球蟲生活史后發(fā)現(xiàn)，位于子孢子和裂殖子前端的微線是構成頂體復合器的重要組成部分，在蟲體入侵宿主細胞的過程中具有重要作用。目前，已證明多種微線蛋白具有良好的免疫原性。艾美耳球蟲的頂膜抗原及其微線蛋白家族蛋白是球蟲重要的微線蛋白，在球蟲入侵宿主細胞、移行以及胞內(nèi)生存方面發(fā)揮重要的作用。但球蟲生活史復雜，一種抗原蛋白只在生命周期的部分階段出現(xiàn)，可能是導致以單一抗原為基礎的亞單

3、位疫苗等新型疫苗在抗球蟲方面僅具有部分免疫保護力的原因之一。因此，改善抗原的免疫原性可能是一個快速和有效的方法。
　　球蟲是胞內(nèi)寄生原蟲，球蟲入侵時機體可以誘發(fā)細胞免疫等的特異性免疫反應。細胞免疫主要包括CD8+T淋巴細胞（細胞毒性T細胞）和CD4+T淋巴細胞（輔助性T細胞）兩種T淋巴細胞。CD4+T細胞和CD8+T細胞在不同種類的球蟲感染過程中發(fā)揮不同的作用而球蟲抗原中的T細胞表位是誘導細胞免疫的關鍵。
　　為了改善抗原的

4、免疫原性，根據(jù)球蟲生活周期及其抗原的表達，選取球蟲不同階段表達的不同抗原蛋白，對其進行蛋白氨基酸序列分析，選取有效的抗原表位構建亞單位疫苗是一種改善抗原免疫原性的可行方案。
　　佐劑是一種非特異性免疫增強劑,能夠提高抗原的免疫原性及改變免疫應答的類型，延長免疫期增強機體的免疫應答能力。不同佐劑的應用會對機體免疫產(chǎn)生不同的影響，選擇合適的佐劑能增強機體產(chǎn)生非特異性或特異性免疫反應，可以提高疫苗免疫的效果,因此佐劑也成為人們增強抗原免

5、疫原性的焦點之一。
　　本研究選取了球蟲子孢子與裂殖子等入侵階段的微線蛋白2（EtMIC2）、微線蛋白3（EtMIC3）和頂膜抗原1（EtAMA1）等幾種重要的微線蛋白基因，利用SYFPEITHI和DNAStar等生物學軟件對其各自的蛋白氨基酸序列進行分析后，分別選擇T細胞表位較為豐富的片段作為亞單位疫苗的候選抗原基因，對基因克隆并線性串聯(lián)，測序正確后克隆入表達載體，轉入大腸桿菌，IPTG誘導表達重組蛋白EtMIC2-EtAMA1

6、-EtMIC3。經(jīng) SDS-PAGE、Western-blot及 IFA鑒定，結果顯示重組大腸桿菌成功表達重組蛋白EtMIC2-EtAMA1-EtMIC3。將重組蛋白EtMIC2-EtAMA1-EtMIC3分別與PBS、弗氏佐劑、松花粉多糖、蜂膠佐劑等乳化后制作亞單位疫苗。在雛雞7和14日齡時頸部皮下多點注射免疫兩次，二免后七天除不免疫不感染球蟲組（Ⅰ組）外皆接種30,000個新鮮柔嫩艾美耳球蟲卵囊。結果顯示各蛋白免疫組相對于感染球蟲不

7、免疫組（Ⅱ組），體重增長顯著，病變積分以及克糞便卵囊數(shù)均顯著性降低（P<0.05）。而乳化佐劑組（IV,V和VI組）與單獨重組蛋白組（III組）比較體重增長升高，病變積分以及克糞便卵囊數(shù)有所降低，其ACI結果顯示重組蛋白質(zhì)能夠對球蟲感染提供良好的免疫保護力，且蜂膠在提高重組蛋白對球蟲感染的免疫保護效果方面作用最理想。淋巴細胞增殖效果及其外周血淋巴細胞中CD4+和CD8+的比例變化結果顯示重組蛋白可以有效誘導細胞免疫，佐劑可以增強重組蛋白