人類胰島素樣生長因子1基因修飾的組織工程生物人工肌肉的構建及表達.pdf

1、本文主要從以下四個部分展開論述：
　　第一部分 人類胰島素樣生長因子1逆轉錄病毒載體的構建
　　目的:構建表達人類胰島素樣生長因子(hIGF1)基因的病毒載體及表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的對照載體,為實現(xiàn)IGF1基因在大鼠骨骼肌成肌細胞中的表達奠定基礎。
　　方法:將目的基因hIGF1CDNA亞克隆到載體pLgXSN載體上,構建重組載體pLg hIGF1SN;同法將目的基因EGFP亞克隆到載體pLgXSN載體上

2、,構建重組載體pLg EGFPSN,并通過酶切,DNA測序鑒定構建載體是否正確。
　　結果:經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序分析表明:插入到載體中的IGF1CDNA及EGFP的基因片段和GENBACK公布的序列相符。
　　結論:表達人類胰島素樣生長因子及增強型綠色熒光蛋白的重組載體pLghIGF1SN、pLgEGFPSN構建成功。
　　第二部分 人類胰島素樣生長因子1逆轉錄病毒載體的包裝及病毒的制備
　　目的:通過

3、乒乓轉導法對病毒載體進行包裝,為介導人類胰島素樣生長因子(hIGF1)在成肌細胞中的表達獲取高滴度的病毒上清。
　　方法:脂質(zhì)體2000為介導,GP+E86和PT67兩種包裝細胞相互乒乓感染的方法,包裝逆轉錄病毒載體pLghIGF1SN, pLgEGFPSN作為對照監(jiān)測包裝效果;包裝成功后通過G418持續(xù)篩選2周,產(chǎn)生穩(wěn)定的病毒生產(chǎn)細胞線。NIH3T3細胞法測定病毒滴度,從中選取高滴度的病毒克隆凍存。
　　結果:(1)脂質(zhì)體

4、轉染后,熒光即時表達效率達30％左右;(2)乒乓感染PT67,24小時后可見熒光蛋白表達;持續(xù)G418篩選2周后,陽性細胞克隆全部表達綠色熒光。(3)PLghIGF1SN組病毒滴度最高可達5×106cfu/ml,滴度明顯高于單純E86包裝法。
　　結論:乒乓感染法可成功對PLghIGF1SN進行包裝,并能獲取高滴度的病毒上清。
　　第三部分 人類胰島素樣生長因子1在大鼠成肌細胞中的表達及活性觀察
　　目的:建立大鼠骨骼

5、肌成肌細胞的大批量培養(yǎng)方法,為試驗提供足夠的細胞;實現(xiàn)hIGF1在成肌細胞中的表達并觀察其對內(nèi)皮細胞凋亡的影響。
　　方法:(1)分別采用消化法及組織塊培養(yǎng)法進行大鼠骨骼肌成肌細胞的培養(yǎng), Desmin和Actin抗體對成肌細胞的純度進行測定,并觀察其生長曲線及凍存復蘇之后的生長規(guī)律。(2)hIGF1病毒上清感染成肌細胞,G418篩選2周,獲得抗性成肌細胞,ELISA檢測上清中hIGF1的表達。(3)內(nèi)皮細胞分組后分別給予OX-L

6、DL及成肌細胞上清干預,MTT法檢測細胞活力;DAPI細胞核熒光染色法觀察細胞凋亡的形態(tài)及細胞凋亡率,western檢測細胞內(nèi)caspase-3及bcl-2的表達,以驗證成肌細胞分泌的hIGF1的生物活性。
　　結果:(1)原代培養(yǎng)的成肌細胞經(jīng)45分鐘差速之后,desmin和actine抗體鑒定顯示純度可達80%以上。經(jīng)適當誘導,可分化為肌管;成肌細胞在培養(yǎng)4天左右進入對數(shù)生長期,凍存之后復蘇的成肌細胞存活率達50%,短期之內(nèi)能快

7、速進入對數(shù)生長期;(2)經(jīng)過G418篩選2周后,成肌細胞表達hIGF1的濃度在30ng/ml左右,總量可以達到(150-200)ng/2×106/d。未轉染成肌細胞組人類胰島素樣生長因子I總量在0.18士0.09/2×106/ d。(3)OX-LDL可明顯抑制內(nèi)皮細胞活力及誘導細胞凋亡,加入成肌細胞分泌的 hIGF1后,細胞凋亡率由17.3±1.21%,下降至6.2±0.75%(P<0.05);caspase-3的表達受抑,bcl-2表

8、達上調(diào)(P<0.05)。
　　結論:消化法和組織塊法均可在短期之內(nèi)獲得大量的成肌細胞,成肌細胞的純度達到90%;大鼠骨骼肌成肌細胞可成功表達外源性蛋白質(zhì)hIGF1,并具有生物活性。
　　第四部分 人類胰島素樣生長因子1修飾的人工肌肉的制備及蛋白質(zhì)表達
　　目的:構建人類胰島素樣生長因子1修飾的組織工程生物人工肌肉,并使其表達外源性人類胰島素樣生長因子1。
　　方法:(1)采用特殊的模型及試劑,使轉染成功的成肌細胞