苦膽鏈霉菌YJ1活性代謝產(chǎn)物的分離純化及其粗提物對油菜菌核病的生物防治.pdf

1、油菜是我國乃至世界上的重要油料作物，油菜菌核病是限制油菜生產(chǎn)的主要因素，利用拮抗放線菌防治油菜菌核病是一種安全有效的生物防治手段。因此，進一步研究拮抗放線菌次級代謝產(chǎn)物有效組分對于研發(fā)出防治油菜菌核病的新型農(nóng)用抗生素具有重要意義。本試驗以實驗室前期工作中篩選出的一株對油菜菌核病菌有較強拮抗活性的苦膽鏈霉菌Streptomyces felleusYJ1為研究對象，通過一系列方法和技術(shù)測定了活性代謝產(chǎn)物的分布及理化性質(zhì)，對其活性物質(zhì)進行分離

2、純化，并測定了其發(fā)酵液粗提物的毒力和抗菌譜及其對油菜菌核病的室內(nèi)盆栽防治效果，為生防放線菌的進一步開發(fā)利用提供了試驗依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.放線菌YJ1活性代謝產(chǎn)物的分布及理化性質(zhì)研究
　　本章通過一系列試驗，確定活性代謝產(chǎn)物廣泛分布于放線菌YJ1發(fā)酵上清液和菌絲體中，抑菌率分別為91.15％、86.95％。然而，菌絲體活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均非常差，不利于進一步分離純化，因此，僅選取發(fā)酵上清液做下一步研究

3、，菌絲體部分則直接過濾舍棄。同時，發(fā)酵上清液中，活性物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性和在中性及堿性條件下的熱穩(wěn)定性均較好，抑菌率達到88.51％以上，只在酸性條件下溫度過高會對活性物質(zhì)造成破壞，所以應(yīng)避免在酸性條件下對活性產(chǎn)物進行高溫處理。通過比較二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇在不同pH值條件下對活性物質(zhì)的萃取效果，確定正丁醇在堿性條件下(pH10)是最佳的萃取條件。此外，溶解性研究結(jié)果表明，活性代謝產(chǎn)物的醇溶性較好，可初步判斷其極性中等偏大。
　　

4、2.放線菌YJ1活性代謝產(chǎn)物的分離純化
　　放線菌YJ1活性產(chǎn)物的分離純化過程主要包括預(yù)處理、萃取、薄層層析(TLC)條件探索、硅膠柱層析分離、TLC產(chǎn)物制備、高效液相色譜(HPLC)分析。研究結(jié)果為:(1)預(yù)處理中，將發(fā)酵液的pH值調(diào)為5以去除雜質(zhì);(2) TLC確定溶劑系統(tǒng)為正丁醇∶甲醇=5∶1(v/v);(3)硅膠柱層析中，采用梯度洗脫，淋洗劑為正丁醇與甲醇;(4)HPLC分析條件:分析色譜柱:Kromasil100-5C1

5、8250×4.6mm;流動相:乙腈∶水=80∶20(v/v);流速:0.8 mL/min;檢測波長:210nm;色譜柱溫度:25℃。
　　3.放線菌Y J1發(fā)酵液粗提物毒力及抑菌譜測定
　　放線菌YJ1發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理后，萃取得到其粗提物。粗提物毒力測定結(jié)果表明，EC50為297.3719μg/mL，EC90為1312.1999μg/mL，相關(guān)系數(shù)r為0.9742。以EC90為基礎(chǔ)，配制粗提物標準液，發(fā)酵液經(jīng)過0.22μm微

6、孔濾膜過濾后作為原液對照，測定二者對15種植物病原真菌的抑制作用。結(jié)果顯示，放線菌YJ1無菌發(fā)酵液及其粗提物標準液對煙草赤星病菌、蘋果落葉斑點病菌、番茄早疫病菌、馬鈴薯早疫病菌、辣椒灰霉病菌、黃瓜炭疽病菌等多種植物病原真菌都有不同程度的抑制作用，抑制率均達到60％以上，抑菌譜基本一致，但無菌發(fā)酵液對植物病原真菌的抑制率要普遍高于粗提物標準液。
　　4.放線菌YJ1無菌發(fā)酵液及其粗提物對油菜菌核病的防治
　　室內(nèi)防病試驗結(jié)果表