杭州地區(qū)犬細(xì)小病毒血清及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus,CPV)是Eugster于1977年從患出血性腸炎犬的糞便中新發(fā)現(xiàn)的一種小DNA病毒,屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒屬(Parvovirus)貓細(xì)小病毒亞群。病犬以嘔吐、出血性腸炎、白細(xì)胞減少為主要特征,并可引起幼犬的心肌炎,對養(yǎng)犬業(yè)危害很大。CPV基因組為單股負(fù)鏈DNA,全長為5323bp,編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)和結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2)。結(jié)構(gòu)蛋白VP2是

2、病毒衣殼蛋白的主要成分,并可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,決定病毒的抗原性和宿主范圍。自從早期CPV-2出現(xiàn)以來,CPV己演化出多種新抗原型,先是CPV-2a于1979年被分離,隨后CPV-2b于1984年被發(fā)現(xiàn)。目前,CPV-2在犬群中已被CPV-2a和CPV-2b所取代。最近,另一種新的抗原型CPV-2c被發(fā)現(xiàn),并被證實(shí)存在于意大利、越南、西班牙、德國、英國、美國以及烏拉圭等國家。本研究主要目的是:(1)建立犬細(xì)小病毒血清抗體間接ELIS

3、A檢測方法,并對杭州地區(qū)CPV血清流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查;(2)從分子流行病學(xué)角度,探明杭州地區(qū)犬細(xì)小病毒的流行和變異情況。
　　 采集疑似病犬糞便,采用同步培養(yǎng)法接種胎貓腎細(xì)胞進(jìn)行病毒分離與鑒定。通過PCR檢測、HA-HI試驗(yàn)、IFA鑒定、電鏡觀察和空斑純化,獲得一株犬細(xì)小病毒,并命名為HZ0761。F81細(xì)胞感染后24h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變;在病料和感染的F81細(xì)胞中均擴(kuò)增出CPV VP2基因的特異性片段;病毒液可凝集豬紅細(xì)胞,血凝

4、價(jià)為1:28,其血凝性能被特異性抗體所抑制;IFA可見特異性亮綠色熒光;電鏡觀察感染的F81核內(nèi)可見20nm左右的病毒顆粒。病毒液的TCID50為104.8/mL,VP2基因序列分析顯示該毒株為CPV-2a。
　　 以HZ0761基因組為模板,擴(kuò)增其VP2基因全長,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-VP2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E coli Rosetta株,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),重組蛋白以包涵體形式表達(dá)。Western-blot表明重組蛋白可以

5、與CPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具有良好的反應(yīng)原性。利用純化后的重組蛋白為抗原,初步建立了CPV血清抗體間接ELISA檢測方法。同時(shí)利用IFA和ELISA方法對杭州地區(qū)犬群CPV血清流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查:共檢測血清84份,IFA陽性56份,陽性率66.7％,ELISA陽性54份,陽性率64.3％。以IFA為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算ELISA方法的敏感性為79.3％,特異性為76.9％。
　　 為探明杭州地區(qū)CPV的流行和變異情況,共收集病料樣品58

6、份。經(jīng)PCR檢測陽性51份,占87.9％。PCR擴(kuò)增陽性病料的VP2基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,克隆入pMD18-T載體中,進(jìn)行序列測定。結(jié)果顯示:51份病料樣品中,CPV-2a45份,占88.2％;CPV-2b6份,占11.8％。分型過程中發(fā)現(xiàn)在42份2a和3份2b中均出現(xiàn)兩處連續(xù)核苷酸變異(970T-A、971A-T)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出,CPV杭州株2a型與2b型各自形成明顯的分支,970/971突變株在各自基因型分支內(nèi)部也形成了

7、明顯的分支,說明CPV杭州株在進(jìn)化上開始顯露其自身的特點(diǎn)。利用SNAP對VP2基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),整個VP2基因較為保守。根據(jù)dN-dS值和extropy值可將VP2分為三個保守區(qū)和兩個易變區(qū)。在四個主要的抗原表位區(qū)中,Loop3和Loop4是最易發(fā)生抗原漂移的區(qū)域,是新突變株發(fā)生突變的主要區(qū)域,也是需要重點(diǎn)調(diào)查和監(jiān)測的區(qū)域。通過與疫苗株序列的比較,我們發(fā)現(xiàn)該地區(qū)野毒株以CPV-2a為主并與疫苗株親源關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　 本研究初步探