棉花GhMAPKKK42響應環(huán)境脅迫并參與植物的生長發(fā)育過程.pdf

1、促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一類存在于各種真核生物體中的絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，通過保守的三級級聯(lián)反應(MAPKKK-MAPKK-MAPK)，接受外界刺激信號，并將細胞外信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)。MAPK級聯(lián)途徑普遍存在于動物、植物和酵母系統(tǒng)中，當植物遭受外界生物或非生物脅迫時，MAPK級聯(lián)途徑就會被啟動，這些脅迫包括:干旱、高鹽、低溫、機械損傷、病原體侵染及活性氧脅迫等

2、。到目前為止，關于MAPK家族成員的報道主要集中在MAPK和MAPKK家族的成員，而對MAPKKK的研究相對有限，尤其是在重要的經(jīng)濟作物棉花中，對MAPKKK的研究幾乎沒有。棉花是我國重要的產(chǎn)纖維和油料的經(jīng)濟作物，本研究以陸地棉（Gossypium hirsutumL.）（魯棉22）為實驗材料，利用同源克隆的方法分離出一個新的MAPKKK基因（GhMAPKKK42），并對其進行了序列分析、表達模式分析及生物學功能分析，具體研究結果如下:

3、
　　(1)通過同源克隆的方法獲得了全長1558bp的cDNA片段，其中包括215bp的5' UTR(untranslated region)，218bp的3'UTR以及1125bp的開放閱讀框(open readingframe，ORF)。ORF編碼一個含有374個氨基酸，等電點為8.89，分子質(zhì)量為42.573kDa的多肽。通過氨基酸序列分析以及聚類分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列含有一個C端激酶結構域并與RAF亞族的氨基酸序列有較高的

4、同源性，因此，我們推斷該基因?qū)儆贛APKKK家族的RAF亞族，命名為GhMAPKKK42。通過亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白定位于細胞核內(nèi)，因此推測其可能在細胞核內(nèi)發(fā)揮相應的生物學功能。
　　(2)通過實時熒光定量PCR(qPCR)的方法對棉花遭受外界環(huán)境脅迫時的表達模式進行分析，研究結果發(fā)現(xiàn)，在低溫(4℃)、機械損傷和信號分子赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)的處理下，GhMAPKKK42的表達量上調(diào);在干旱、高鹽、青枯勞爾氏菌（R

5、.solanacearum）、立枯絲核菌（R.Solani）和信號分子茉莉酸甲酯(MeJA)、脫落酸(ABA)的處理下，GhMAPKKK42的表達量下調(diào)，說明GhMAPKKK42響應各種生物及非生物脅迫以及信號分子的調(diào)節(jié)。
　　(3)利用hi-TAIL PCR的方法獲得了基因GhMAPKKK42長1104bp的啟動子序列，通過Plantcare軟件對該序列進行分析，結果顯示，該啟動子序列中含有與溫度相關的作用元件LTR和HSE，響

6、應信號分子GA的作用元件GARE-motif和P-box，還有與組織發(fā)育相關的作用元件GCN4_motif和as-2-box，說明GhMAPKKK42可能參與調(diào)控溫度脅迫并參與植物的生長發(fā)育過程。
　　(4)對超表達轉(zhuǎn)基因煙草植株進行功能分析發(fā)現(xiàn)，在干旱和鹽處理下，超表達植株的種子萌發(fā)率低于野生型煙草種子，通過檢測相關抗氧化酶基因的表達量發(fā)現(xiàn)干旱和高鹽處理后，轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)相關抗氧化酶基因的表達量降低，其清除活性氧的能力減弱，說明轉(zhuǎn)

7、基因植株對干旱和高鹽處理敏感;病原菌侵染葉片后，轉(zhuǎn)基因煙草的葉片上有較大的黃斑面積和較多的H2O2積累，通過檢測相關抗病基因的表達量，發(fā)現(xiàn)抗病基因PR1c、 PR2和PR4的表達量下降，說明轉(zhuǎn)基因煙草植株對青枯菌敏感，而且與相關抗病基因的表達有關;在低溫處理下，轉(zhuǎn)基因植株受到的傷害程度較輕，并且轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)有較少的丙二醛(MDA)和較多的可溶性糖積累，相關抗氧化酶的活性也比野生型煙草高，說明轉(zhuǎn)基因植株在低溫(4℃)處理下表現(xiàn)為抗性。