野生柑橘響應韌皮部桿菌亞洲種侵染的生物學和轉(zhuǎn)錄組學研究.pdf

1、柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是當前世界柑橘產(chǎn)業(yè)的頭號殺手。該病能侵染幾乎所有的柑橘栽培品種，目前尚無有效治愈手段。其病原暫定于α-變型菌綱（Proteobacteria）、韌皮桿菌屬（Liberibacter），是一種韌皮部專性寄生的難培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌，根據(jù)16S rDNA序列不同可將其分為三個種：亞洲種（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, Las）、非洲種（‘C

2、a. Liberibacter africanus’, Laf）、美洲種（‘Ca. Liberibacter americanus’, Lam），其中Las分布最廣，且危害最大。迄今，在柑橘栽培種中尚未發(fā)現(xiàn)黃龍病抗性基因，嚴重制約了抗性育種的進程。有研究表明，馬蜂柑（Citrus hystrix）對黃龍病具有一定的耐病性，但其耐病機制尚不清楚。中國是世界柑橘的重要起源中心，有著豐富的野生柑橘資源，而這些野生資源對黃龍病的抗感性缺乏系統(tǒng)研

3、究。因此，本研究以馬蜂柑、宜昌橙（C. ichangensis）、道縣野橘（C. daoxianensis）等野生柑橘資源為研究材料，以甜橙（C. sinensis）為敏感對照品種，接種毒源后進行生物學癥狀觀察，并利用定量多聚酶鏈式反應（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）定期檢測Las在不同寄主中的含量變化；同時對其進行比較轉(zhuǎn)錄組分析，以期從轉(zhuǎn)錄水平上解析野生柑橘和甜橙對Las的應

4、答機制差異，為抗/耐黃龍病常規(guī)和轉(zhuǎn)基因育種提供新思路。所獲得的主要研究結果如下：
　　1.通過毒源嫁接和qPCR定期檢測，結果表明，野生柑橘和甜橙均在接種約90 d能檢測到Las。進一步比較宜昌橙、道縣野橘和甜橙中病原菌含量的變化，發(fā)現(xiàn)從接種約120 d開始，Las在甜橙中的含量遠高于宜昌橙和道縣野橘，初步表明Las在甜橙中的增殖速度高于野生柑橘；癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，馬蜂柑和宜昌橙幾乎不顯癥，道縣野橘部分葉片出現(xiàn)輕微黃化，而甜橙感染黃龍

5、病后表現(xiàn)出明顯的葉片變小、黃化的現(xiàn)象，表明馬蜂柑和宜昌橙對黃龍病具有潛在的耐病性。
　　2.對感染初期的耐病品種馬蜂柑和感病品種甜橙進行了轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出耐病相關的差異表達基因并進行了qPCR驗證。結果表明，甜橙感染Las后共有604個基因差異表達，其中254個上調(diào)，350個下調(diào)，而馬蜂柑感染Las后共252個基因差異表達，其中179個上調(diào)，73個下調(diào)，染病馬蜂柑與染病甜橙相比共有4651個基因差異表達，其中2137個上調(diào)，25

6、14個下調(diào)。Las誘導的代謝途徑涉及糖代謝、光合作用、細胞壁代謝、次生物質(zhì)代謝、PR-蛋白（Pathogenesis Related Protein）、氧化還原反應等。值得注意的是，與健康對照相比，染病甜橙中編碼淀粉合成酶（glgA）的兩個基因上調(diào)表達4倍以上，與淀粉分解有關的β-淀粉酶（BAM）基因下調(diào)表達，而它們在染病馬蜂柑中表達無顯著差異。染病馬蜂柑中大部分與細胞壁和次生產(chǎn)物代謝途徑相關的基因上調(diào)表達，而甜橙中該途徑相關基因大部分

7、下調(diào)表達。另外，多個與植物抗病相關的PR-蛋白相關基因被Las誘導差異表達，部分抗病蛋白相關基因的表達水平較敏感品種更高。RT-qPCR驗證結果表明，在挑選的20個差異表達基因中，18個基因的驗證結果與RNA-seq測序結果的變化趨勢基本保持一致，表明了RNA-seq具有較高的可靠性和準確性。
　　3.對宜昌橙、道縣野橘和甜橙進行了感病后期的轉(zhuǎn)錄組測序，結果顯示，宜昌橙、道縣野橘和甜橙接種Las約240 d分別有592、987和2

8、844個基因差異表達，與其接種Las后的顯癥程度呈現(xiàn)出一致性。Las侵染后期，與致病相關的淀粉合成、PP2蛋白相關基因在甜橙和道縣野橘中均上調(diào)表達，尤其是甜橙，但在宜昌橙中沒有明顯變化，推測可能是宜昌橙不顯癥的主要原因。同時，次生產(chǎn)物代謝途徑在3個品種中被激活，纖維素合成相關基因在宜昌橙和道縣野橘中上調(diào)表達，但在甜橙中下調(diào)表達；甜橙中大量PR-蛋白相關基因表達被抑制，而宜昌橙和道縣野橘相對較少；部分抗病蛋白基因在野生柑橘品種中表達水平較

9、高。
　　4.不同野生柑橘品種對Las侵染的應答反應存在一定的相似性，尤其是馬蜂柑和宜昌橙。4個柑橘品種感染黃龍病后，與植物防御相關的代謝途徑中大量差異表達基因均被誘導上調(diào)表達。然而，3個野生柑橘品種中均有部分抗病蛋白相關基因的表達水平較甜橙更高，在一定程度上增強了耐病性。此外，道縣野橘中淀粉代謝、PP2蛋白相關基因的表達雖上調(diào)但不及甜橙顯著，推測這可能是道縣野橘染病后出現(xiàn)輕微黃化的主要原因，而馬蜂柑和宜昌橙中該類基因均未被誘導差