NGF殼聚糖微球—高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備及其促神經(jīng)損傷修復的研究.pdf

1、周圍神經(jīng)缺損是臨床最常見的創(chuàng)傷之一。直接縫合和自體神經(jīng)移植是治療該疾病最常用的兩種方法，然而，這兩種治療方法均存在一定的局限性。近年來，神經(jīng)組織工程學的迅速發(fā)展為臨床治療神經(jīng)缺損帶來新的希望。多種以天然或人工合成多聚物為主要原料的中空神經(jīng)支架，如NeurotubeTMPGA和NeuraGenTMCollagen等，已經(jīng)獲得美國食品與藥物管理局（FDA）認證，可在臨床應用。然而，這些中空神經(jīng)支架對長節(jié)段神經(jīng)缺損的修復效果并不理想。分析原因

2、后，我們認為中空神經(jīng)支架缺乏有效的仿生微結構和神經(jīng)營養(yǎng)功能。
　　大量基礎研究表明：神經(jīng)支架內部的微管樣結構可有效引導雪旺細胞線形排列，對引導再生神經(jīng)定向生長起到關鍵作用。本課題組前期制備了一種新型膠原-殼聚糖高仿生神經(jīng)支架（CCH），該支架具有軸向平行排列的微管樣結構，與正常神經(jīng)的基底膜結構相似，實驗結果表明：CCH仿生支架可引導再生神經(jīng)定向生長。然而，CCH仿生支架還缺乏有效的神經(jīng)營養(yǎng)功能，這是促進神經(jīng)再生的另一個重要因素。因

3、此，應用CCH仿生支架聯(lián)合神經(jīng)營養(yǎng)因子有望進一步提高神經(jīng)缺損的修復效果，更好更快的促進神經(jīng)再生。目前，營養(yǎng)因子復合神經(jīng)支架最常用的方法是“物理吸附”—將營養(yǎng)因子通過微型注射器注入神經(jīng)支架內部。盡管“物理吸附”操作簡單，對支架的微結構無明顯影響，但是該復合方法可降低營養(yǎng)因子的緩釋性能和生物利用率。因此，尋找一種可提高營養(yǎng)因子的緩釋性能、保護其生物活性的緩釋載體至關重要。
　　本研究選用殼聚糖為主要原料，應用“乳化-離子交聯(lián)”技術，制

4、備包埋神經(jīng)生長因子的殼聚糖微球（NGF-CMSs），交聯(lián)劑為三聚磷酸鈉（STPP）。體外緩釋動力學和緩釋生物學結果表明：NGF-CMSs可控性緩釋具有生物活性的神經(jīng)生長因子。隨后，我們在制備具有微管樣結構的CCH仿生支架的基礎上，應用“后復合”技術將NGF-CMSs復合于CCH仿生支架，制備NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)（NGF-CMSs/CCH）。NGF-CMSs/CCH具有平行排列的微管樣結構，殼聚糖微球較均勻分布在微管樣結構

5、內。體外實驗結果表明：NGF-CMSs/CCH可顯著降低神經(jīng)生長因子的“突釋量”和緩釋率，可控性緩釋具有生物活性的神經(jīng)生長因子，提高神經(jīng)生長因子的生物利用率。應用NGF-CMSs/CCH修復大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損，體內實驗結果表明：該緩釋系統(tǒng)可加快神經(jīng)再生速度，縮短再生神經(jīng)軸突到達靶肌肉的時間，促進神經(jīng)運動功能恢復。整個研究分為以下兩個部分：
　　第一部分：NGF-CMSs的制備及其相關性能的實驗研究
　　目的：制備NGF

6、-CMSs；檢測NGF-CMSs相關性能。
　　方法：以殼聚糖為主要原料，應用“乳化-離子交聯(lián)”技術，制備NGF-CMSs；分別使用不同濃度的STPP溶液（1％、3％、5％及10％（w/v））對殼聚糖微球進行交聯(lián)；應用傅里葉紅外光譜（FTIR）分析STPP與殼聚糖交聯(lián)情況；應用掃描電鏡、粒徑分布、包埋率、載藥率以及體外緩釋動力學對不同交聯(lián)濃度的NGF-CMSs性能進行篩選，并確定最佳交聯(lián)濃度；利用PC12細胞活力測定和MTT實驗評

7、估NGF-CMSs的緩釋生物學性能。
　　結果：掃描電鏡結果顯示：不同交聯(lián)濃度的NGF-CMSs均具有球形結構，表面相對粗糙，大小不等，STPP濃度對微球的表面形態(tài)無明顯影響；傅里葉紅外光譜結果顯示：殼聚糖的氨基和STPP的磷酸基發(fā)生靜電反應，說明STPP與殼聚糖微球交聯(lián)成功；STPP濃度對NGF-CMSs的平均粒徑、包埋率、載藥率以及緩釋動力學性能均有顯著影響，NGF-CMSs的平均粒徑在20.5～31.2μm之間，且隨著STP

8、P濃度的增加而增大；NGF-CMSs的包埋率在62.8％～87.9％之間，載藥率在1.8％～12.5％之間，這兩者均隨著STPP濃度的增加而減小；NGF-CMSs持續(xù)緩釋NGF達7天，NGF緩釋率隨著STPP濃度的增加而減少；NGF-CMSs的緩釋液可維持PC12細胞的生物活性，并誘導其分化為神經(jīng)元表型，表明NGF-CMSs有效緩釋具有生物活性的NGF，提高NGF生物利用率。
　　結論：經(jīng)過篩選，我們確定3％STPP為最佳交聯(lián)濃度

9、。3％STPP交聯(lián)的NGF-CMSs具有良好的平均粒徑、較高的包埋率和載藥率、可控的緩釋動力學性能以及穩(wěn)定的緩釋生物學性能，為下一步將其復合于高仿生神經(jīng)支架，修復神經(jīng)缺損奠定良好基礎。
　　第二部分：NGF殼聚糖微球-高仿生支架緩釋系統(tǒng)的制備及其修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗研究
　　目的：制備NGF-CMSs/CCH緩釋系統(tǒng)，探討NGF-CMSs/CCH緩釋系統(tǒng)修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的效能。
　　方法：應用“后復合”技術將

10、NGF-CMSs復合于CCH高仿生支架，制備NGF-CMSs/CCH緩釋系統(tǒng)；應用掃描電鏡觀察NGF-CMSs/CCH微結構；應用體外緩釋動力學及緩釋生物學檢測NGF-CMSs/CCH的緩釋性能；分別將NGF-CMSs/CCH和其他神經(jīng)支架組橋聯(lián)大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損后，應用神經(jīng)電生理、熒光金逆行示蹤標記以及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)明確再生神經(jīng)的功能恢復情況，應用組織形態(tài)計量學和靶肌肉形態(tài)學評估神經(jīng)再生情況。
　　結果：NGF-CMSs

11、/CCH緩釋系統(tǒng)具有軸向平行排列的微管樣結構，NGF-CMSs較均勻分布在微管樣結構內；與單純將NGF物理吸附于CCH支架相比（NGF/CCH組），該緩釋系統(tǒng)能顯著降低NGF的“突釋量”及緩釋率，可控性緩釋具有生物活性的NGF達12周；NGF-CMSs/CCH組的神經(jīng)再生和運動功能的恢復程度顯著優(yōu)于NGF/CCH組和CCH組。
　　結論：NGF-CMSs/CCH緩釋系統(tǒng)可加快神經(jīng)再生速度，縮短再生神經(jīng)軸突到達靶肌肉的時間，促進神經(jīng)