桑粒肩天牛幼蟲(chóng)腸道微生物多樣性的分子生物學(xué)方法研究.pdf

1、桑粒肩天牛是是鞘翅目天?？频囊粋€(gè)很大的類群，一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，它們危害多種林木和木質(zhì)產(chǎn)品。昆蟲(chóng)的腸道生活著大量的微生物，這些微生物和宿主相互作用，相互影響，對(duì)宿主的生長(zhǎng)發(fā)育，營(yíng)養(yǎng)代謝和疾病防御有著非常重要的作用。依靠純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)的方法研究腸道微生物的多樣性存在著很多的局限性，因?yàn)樽匀唤绯^(guò)99％的微生物，在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件下都不能培養(yǎng)。而分子生物學(xué)的方法能夠突破培養(yǎng)的瓶頸。
　　本試驗(yàn)使用基于16S rDNA-PCR的變

2、性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，限制性片段多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和均一化克隆文庫(kù)技術(shù)研究桑粒肩天牛幼蟲(chóng)腸道微生物多樣性。使用DGGE分析方法，從桑粒肩天牛腸道微生物的16S rDNA擴(kuò)增片段切膠回收22個(gè)不同條帶，經(jīng)過(guò)分別測(cè)序，顯示出它們屬于15個(gè)屬細(xì)菌。其中，一株不可培養(yǎng)的變形菌

3、屬菌株（Proteobacterium）和一株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的細(xì)菌幾乎都出現(xiàn)在檢測(cè)的樣品中。DGGE凝膠中最亮的兩個(gè)條帶分別被鑒定為芽孢桿菌屬的菌株（Bacillus sp.）和克雷伯氏菌屬菌株（Klebsiella sp.）。即通過(guò)DGGE圖譜表現(xiàn)出來(lái)的優(yōu)勢(shì)菌為桿菌和克雷伯氏菌。DGGE圖譜還反映了天牛腸道微生物的季節(jié)變化，夏季的腸道菌群較冬季更為豐富。同時(shí)，構(gòu)建了一個(gè)傳統(tǒng)的桑粒肩天牛幼蟲(chóng)腸道16S rDNA克隆

4、文庫(kù)和一個(gè)均一化16S rDNA克隆文庫(kù)。用限制性酶切片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法分析建立的傳統(tǒng)克隆文庫(kù)，根據(jù)不同的酶切指紋圖譜將175個(gè)克隆子歸為48個(gè)不同的分類操作單元（OTUs）。每個(gè)分類操作單元選擇一個(gè)代表克隆子進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)比對(duì)，這48個(gè)OTUs分別屬于22個(gè)不同的細(xì)菌屬，其中的優(yōu)勢(shì)菌是來(lái)自克雷伯氏菌屬（Klebsiella），乳球菌屬（Lacto

5、coccus）和腸球菌屬（Entorococcus）的細(xì)菌，它們分別占所檢測(cè)克隆總數(shù)的24.6%,19.4%和17.1%。此結(jié)果顯示，RFLP分析方法比DGGE分析方法具有更高的分辨率。
　　均一化技術(shù)被首次用于環(huán)境中微生物多樣性的研究。在克隆的均一化文庫(kù)中，隨機(jī)測(cè)序的82個(gè)克隆包含了79種不同的細(xì)菌，它們分別屬于32個(gè)屬，17個(gè)科和7個(gè)門或者亞門。其中，來(lái)自醋酸桿菌屬（Acetobacter）,弓形桿菌屬（Arcobacter）

6、,短波單胞菌屬（Brevundimonas）,氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）,克呂沃爾菌屬（Kluyvera）,泛菌屬（Pantoea），Grimontella和涅斯捷連科氏菌屬（Nesterenkonia）等8個(gè)屬的細(xì)菌在傳統(tǒng)以RFLP方法分析的傳統(tǒng)文庫(kù)中和以DGGE直接分析的方法中都沒(méi)有檢測(cè)到。此外，由于用于分析的序列接近16S rDNA的全長(zhǎng)，兩個(gè)文庫(kù)也提供了比直接的16S rDNA PCR擴(kuò)增片段的DGGE分析更為詳

7、盡的生物多樣性信息。使用CLUSTAL W和PHYLIP(version3.67)等軟件對(duì)所得到的序列進(jìn)行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)中得到的部分菌群與基因庫(kù)中已知菌群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)，較為獨(dú)特。
　　三種分子生物學(xué)方法展示了桑粒肩天牛腸道中棲息著超過(guò)我們預(yù)料的豐富的微生物群體，總共有140多種，來(lái)自9個(gè)門，22個(gè)科和44個(gè)屬。這個(gè)結(jié)果證明了直接提取DNA和擴(kuò)增16S rDNA的分子生物學(xué)方法比傳統(tǒng)的基于純培養(yǎng)的方法能得到更多的微生