某醫(yī)院住院患者呼吸道細(xì)菌感染流行病學(xué)及克雷伯氏菌分子生物學(xué)特征研究.pdf

1、呼吸道細(xì)菌感染是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，隨著疾病譜的改變、治療新技術(shù)的運(yùn)用和經(jīng)驗(yàn)用藥，導(dǎo)致條件致病菌引起的呼吸道感染增多、細(xì)菌譜變化和對(duì)抗生素耐藥性不斷增高。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是呼吸道感染和院內(nèi)感染的常見(jiàn)致病菌，近年來(lái)，隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素的大量使用，產(chǎn)生了對(duì)美羅培南或亞胺培南耐藥的腸桿菌。而肺炎克雷伯菌一旦產(chǎn)生碳青酶烯酶(Klebsiella pneumoniae Carbapenemase，

2、KPC)幾乎可以對(duì)所有β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥作用。
　　本課題對(duì)上海市某肺部專(zhuān)科醫(yī)院呼吸道感染細(xì)菌譜、耐藥譜和臨床特征進(jìn)行調(diào)查，著重了解克雷伯菌感染所致肺炎的流行現(xiàn)狀、抗生素耐藥情況及分子生物學(xué)特征，探索KPC耐藥菌傳播的危險(xiǎn)因素和分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床進(jìn)一步有效控制KPC耐藥菌傳播提供科學(xué)依據(jù)。本研究共分為以下三個(gè)部分:
　　第一部分住院患者呼吸道細(xì)菌感染流行病學(xué)研究
　　目的調(diào)查上海市某肺部專(zhuān)科醫(yī)院住院患者呼

3、吸道細(xì)菌感染譜、臨床特點(diǎn)、耐藥情況及可疑危險(xiǎn)因素分布，為有效控制住院患者呼吸道細(xì)菌感染提供依據(jù)。方法以連續(xù)三個(gè)月內(nèi)入住該院呼吸內(nèi)科和胸外科的因疑似呼吸道感染而送檢痰普培標(biāo)本的病人為研究對(duì)象開(kāi)展橫斷面調(diào)查，通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)、耐藥檢測(cè)、病史記錄查詢(xún)和問(wèn)卷調(diào)查等方式，了解住院患者呼吸道細(xì)菌性感染陽(yáng)性率、細(xì)菌譜和耐藥分布，分析影響住院患者發(fā)生呼吸道細(xì)菌感染的主要危險(xiǎn)因素。結(jié)果研究共識(shí)別合格對(duì)象1865例，其中完成痰標(biāo)本收集的患者為1290例，從中分

4、離到呼吸道感染細(xì)菌菌株249株，細(xì)菌感染陽(yáng)性率為19.30％?；颊吆粑兰?xì)菌感染的分布依次為:肺炎克雷伯菌137例(55.0％)，銅綠假單伯菌30例(12.0％)，鮑曼不動(dòng)菌30例(12.0％)，陰溝腸桿菌15例(6.0％)，大腸埃希菌8例(3.2％)和金黃色葡萄球菌1例，此外還有其它細(xì)菌感染28例(11.2％)。249例感染患者中科室分布情況，結(jié)核科29例(9.6％)、塵肺科31例(18.8％)、呼吸科21例(7.0％)、腫瘤科65例

5、(14.8％)、胸外科(監(jiān)護(hù)室)101例(15.3％)，各科室的致病菌感染存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=70.347，p=0.000），在各科室中，塵肺科的檢出率最高，其次是胸外科和腫瘤科;致病菌感染年齡分布情況，＜40歲21例(8.2％)、40～歲26例(10.3％)、50～歲72例(13.3％)、60～歲67例(12.8％)，≧70歲61例(21.6％)，各年齡段致病菌檢出率存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=17.634，p=0.001)，隨年齡的增

6、長(zhǎng)而提高，≧70歲的老年病人最高;不同就業(yè)狀態(tài)致病菌分布情況:退休陽(yáng)性172例(22.9％)、在職68例(14.4％)、待業(yè)4例(8.2％)，不同就業(yè)狀態(tài)的對(duì)象致病菌感染構(gòu)成比不同，退休的患者感染高于在職和待業(yè)的患者(x2=18.060，p=0.000);男性178例(14.5％)，女性69例(10.8％)男性與女性致病菌感染未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(x2=2.784，p=0.095);測(cè)定249株細(xì)菌對(duì)16種抗菌藥物的敏感性，130株肺炎克

7、雷伯氏菌敏感性＞80％的為氨芐西林/舒巴坦(86.9％)、阿米卡星(93.4％)、氨曲南(89.8％)、環(huán)丙沙星(92.7％)、頭孢曲松(89.1％)、頭孢唑林(83.9％)、厄他培南(93.4％)、頭孢匹美(89.1％)、慶大霉素(91.2％)、亞胺培南(92.0％)、左氧氟沙星(92.0％)、復(fù)方新諾明(85.4％)、頭孢他啶(88.3％)、妥布霉素(92.0％)，耐藥率＞80％的為氨芐西林(90.5％);30株銅綠假單胞菌敏感性＞

8、80％的為阿米卡星(100％)、氨曲南(100％)、環(huán)丙沙星(96.7％)、頭孢匹美(96.7％)、慶大霉素(100％)、亞胺培南(93.3％)、左氧氟沙星(90％)、頭孢他啶(100％)、妥布霉素(100％)，耐藥率＞80％的為氨芐西林(100％)、氨芐西林/舒巴坦(100％)、頭孢唑林(96.7％)、呋喃妥因(100％)、復(fù)方新諾明(100％)，30株孢曼不動(dòng)菌敏感性＞80％的為氨芐西林/舒巴坦(86.7％)、阿米卡星(96.7％)

9、、環(huán)丙沙星(83.3％)、頭孢匹美(86.7％)、慶大霉素(83.3％)、亞胺培南(86.7％)、左氧氟沙星(86.7％)、復(fù)方新諾明(80％)、頭孢他啶(86.7％)、妥布霉素(90％)，耐藥率＞80％的為氨芐西林(96.7％)、頭孢曲松(96.7％)、頭孢唑林(96.7％)、呋喃妥因(96.7％)。進(jìn)一步分析呼吸道細(xì)菌感染病例的臨床特征，患者在入院前抗生素的使用情況:不同性別之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(x2=4.934，p=0.294);

10、不同年齡組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=26.734，p=0.045)，其中50～歲使用1種和≧3種抗生素最多，分別為37.8％和38.9％、60～歲使用2種抗生素最多占29.8％;不同病區(qū)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=307.76，p=0.000），使用1種抗生素依次為呼吸科(31.6％)、腫瘤科(27.6％)、胸外科ICU(21.4％)、結(jié)核科(19.4％)、塵肺科(0)，使用2種抗生素依次為呼吸科(51.9％)、結(jié)核科(19.2％)腫瘤科(15.4％

11、)、胸外科ICU(13.5％)、塵肺科(0)，使用≧3種抗生素依次為呼吸科(38.9％)、結(jié)核科(29.2％)腫瘤科(26.4％)、胸外科ICU(5.6％)、塵肺科(0)，抗生素使用呼吸科最高，塵肺科均沒(méi)用;影響住院病人肺部細(xì)菌性感染相關(guān)的危險(xiǎn)因素，單因素分析:各年齡段細(xì)菌性感染有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=17.634，p=0.001)依次為50～歲(29.1％)、60～歲(27.1％)、≧70歲(24.7％)、40～歲(10.5％)、＜40歲

12、(8.5％);性別和入院前住院次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異;住院前臨床特征分析:有肺葉切除史、氣管鏡操作史、肺穿刺史、激素使用史、胸腔插管史、放化療史和糖尿病史對(duì)細(xì)菌感染均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異;入院后肺部手術(shù)(x2=6.259，p=0.012)、氣管鏡檢查(x2=6.707，p=0.010)、呼吸機(jī)使用（x2=8.537，p=0.003）對(duì)呼吸道感染有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，氣管插管、胸腔插管和肺穿刺無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。
　　結(jié)論上海市某肺部專(zhuān)科醫(yī)院住院患

13、者送檢痰標(biāo)本細(xì)菌檢出陽(yáng)性率19.30％，其中革蘭氏陰性菌檢出率＞80％，高于文獻(xiàn)報(bào)道。249例感染患者塵肺科的檢出率最高，呼吸科最低。130株肺炎克雷伯氏菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥物敏感，對(duì)氨芐西林耐藥率為90.5％;30株銅綠假單胞菌對(duì)多數(shù)抗菌藥物敏感，對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑林均完全耐藥;30株孢曼不動(dòng)菌對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑林耐藥。所以，在經(jīng)驗(yàn)性使用抗菌藥物時(shí)，應(yīng)盡量避免使用以上耐藥率較高的抗生素。不同病區(qū)使用抗生素有統(tǒng)計(jì)

14、學(xué)意義，呼吸科最高，塵肺科均沒(méi)用，結(jié)合致病菌的感染情況，早期合理使用抗生素對(duì)控制細(xì)菌感染有幫助。入院后肺部手術(shù)、氣管鏡檢查、呼吸機(jī)使用對(duì)呼吸道感染有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明入院后的侵入性操作和治療容易引起呼吸道感染，所以應(yīng)做好設(shè)備的消毒和滅菌。氣管插管、胸腔插管和肺穿刺無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示應(yīng)盡可能使用一次性的醫(yī)療器械，可以避免人群間的交叉感染。
　　第二部分肺炎克雷伯氏菌耐藥相關(guān)基因特征研究
　　目的研究上海市某肺部專(zhuān)科醫(yī)院肺炎克雷伯

15、氏菌抗生素的易感性和由廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和AmpC酶質(zhì)粒介導(dǎo)的基因分型。方法連續(xù)三個(gè)月從檢驗(yàn)科收集的211例肺炎克雷伯氏菌陽(yáng)性標(biāo)本。通過(guò)微掃描MIC方法檢測(cè)細(xì)菌抗生素的敏感性，用PCR擴(kuò)增與DNA純化分離對(duì)ESBLs和AmpC酶作表型鑒定。
　　結(jié)果在所研究的211株肺炎克雷伯氏菌中，經(jīng)表型試驗(yàn)確認(rèn)有78株產(chǎn)ESBLs，產(chǎn)ESBLs菌對(duì)氨芐西林全部耐藥，而非產(chǎn)ESBLs菌對(duì)氨芐西林耐藥率為77.4％，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、意義(p=0.0001)。產(chǎn)ESBLs菌對(duì)氨曲南和頭孢他啶的耐藥率分別為20.5％和15.4％，與非產(chǎn)ESBLs菌（0.8％和1.5％）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。產(chǎn)AmpC酶菌株對(duì)頭孢他啶、氨曲南、環(huán)丙沙星和阿米卡星敏感性明顯降低（p＜0.05）。CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性菌株基因型均為CTX-M-3。比較不同ESBLs耐藥相關(guān)基因型對(duì)抗生素的耐藥率。所有SHV陽(yáng)性菌株對(duì)氨芐西林耐藥，明顯高于SHV陰性菌株，差別有

17、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100％.vs.75％，x2=26.52，p=0.0001)。TEM陽(yáng)性菌株對(duì)頭孢他啶的耐藥率要明顯高TEM陰性菌株(10.3％.vs.2.4％，x2=4.19，p=0.041)， CTX陽(yáng)性菌株對(duì)頭孢他啶(13.5％.vs.4.0％，x2=5.12，p=0.024)和氨曲南(16.2％.vs.4.6％，x2=6.65，p=0.001)耐藥率要高于CTX陰性菌株，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論本地區(qū)肺炎克雷伯氏菌產(chǎn)ESBLs狀況已很

18、嚴(yán)重。研究顯示該院臨床分離的肺炎克雷伯菌主要存在SHV-1型和TEM型ESBLs流行。通過(guò)檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌ESBLs基因和產(chǎn)ESBLs酶，以及ampC基因和產(chǎn)AmpC酶，可為臨床醫(yī)師的合理用藥提供一定指導(dǎo)。
　　第三部分肺炎克雷伯氏菌基因分型及流行特征研究
　　目的研究上海市某肺部專(zhuān)科醫(yī)院住院患者呼吸道肺炎克雷伯氏菌基因分型及與臨床耐藥的關(guān)系。方法通過(guò)抗生素敏感試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增、MLST分析網(wǎng)絡(luò)(www.mist.net)

19、進(jìn)行分析。結(jié)果對(duì)211株KP菌株進(jìn)行MLST分析，有94種不同的序列型。通過(guò)eBURST分析，發(fā)現(xiàn)所識(shí)別的60種ST型可以進(jìn)一步組成三種主要的克隆系(clonal complex)和10種單一型(singletons)。分析不同克隆系對(duì)抗生素藥物的敏感情況結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除CC259克隆系外，其他克隆系及獨(dú)株普遍對(duì)氨芐西林有較高的耐藥比例，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)無(wú)明顯差異。CC5021克隆和CC340克隆對(duì)頭孢他啶耐藥率分別為11.1％和10％，明顯高于

20、其他克隆系菌株和獨(dú)株，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。所有克隆系和獨(dú)株對(duì)氨曲南的耐藥率在10％左右。另外，CC340克隆系對(duì)于環(huán)丙沙星和阿米卡星的耐藥率分別為13.3％和16.7％，明顯高于其他克隆系菌株和獨(dú)株(p＜0.05)。進(jìn)一步分析不同克隆系中耐藥相關(guān)基因分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同克隆系中SHV-1型基因陽(yáng)性的比例相當(dāng)，在39.7％～42.1％不等，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CC5021和CC340克隆系中TEM、CTX-M型基因陽(yáng)性比例分

21、別為74.1％和70％，且明顯高于其他克隆系菌株和獨(dú)株(p＜0.05)。通過(guò)單因素和多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要流行菌株感染患者中更有可能是來(lái)自呼吸科(25％.vs.15％，OR=1.25;95％ CI:1.018～3.624)。同時(shí)感染主要流行菌株患者的住院天數(shù)要明顯高于感染其他菌株的患者(OR=1.03;95％CI:1.020～2.340)。同時(shí)肺部感染是送檢主要流行菌株最主要的原因(OR=1.67;95％CI:1.118～4.578

22、)。結(jié)論本院流行的KP菌株與全球流行菌株有一定的遺傳相關(guān)性。醫(yī)院及周?chē)牡貐^(qū)存在某些KP克隆系的地方性流行。ST258型被認(rèn)為是引起碳青霉烯酶耐藥全球流行的主要菌群。對(duì)于感染ST11序列型KP株的患者即使識(shí)別和治療有助于更好地控制抑制碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥菌株在人群間的流行。blaCTX-M/blaTEM陽(yáng)性KP菌對(duì)于頭孢菌素類(lèi)抗生素耐藥性較高，主要流行株具有較強(qiáng)的傳播力，但毒力與其他菌株相當(dāng)。有必要在臨床和治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)這些主要流行菌株及