沈陽某醫(yī)院患者感染細菌的分子流行病學和耐藥趨勢及同源性研究.pdf

1、目的:感染性疾病始終是嚴重危害人類健康的常見病多發(fā)病。世界范圍內(nèi)感染每年影響著數(shù)以千萬計的人的健康與生命，在過去的十年里，感染與重癥感染的發(fā)生率分別為437/10萬和270/10萬。而感染/重癥感染而致的死亡率高達17％/26％。來自高收入國家的數(shù)據(jù)初步推斷每年感染人數(shù)為3150萬，重癥感染人數(shù)為1940萬例。更為嚴重的是，隨著抗生素的過度應(yīng)用，耐藥菌株在持續(xù)增多，細菌耐藥與變異株產(chǎn)生的速度甚至超過新型抗生素的研制與開發(fā)?？垢腥局委熞呀?jīng)

2、成為臨床醫(yī)生面臨的棘手問題。此外，住院患者發(fā)生的醫(yī)源性或院內(nèi)感染也已成為臨床工作中一個突出問題。因而，監(jiān)測感染細菌的種類、感染來源、流行與耐藥趨勢對于感染性疾病的治療和預(yù)防具有重要意義，對于有效預(yù)防和控制院內(nèi)感染的發(fā)生及防止耐藥菌株的產(chǎn)生與蔓延更具其特殊意義。
　　沈陽陸軍總院，作為一所現(xiàn)代化綜合性三級甲等醫(yī)院，不僅各科室收治的感染性疾病所占份額較大，而且，作為國內(nèi)技術(shù)領(lǐng)先的腦外科和心血管外科收治的急重癥患者、外傷或手術(shù)患者合并感

3、染的機會也很多，且感染類型復(fù)雜。此外，細菌耐藥形勢也是十分嚴峻，例如，肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥率在2014年和2015年分別波動在0.5～1.5％與0.8～1.9％之間，但是到了2016年，呈現(xiàn)明顯上升趨勢，甚至在第二季度達到了10.2％和16.5％。尤其是在急診ICU、呼吸內(nèi)科和神經(jīng)外科部分手術(shù)科室及老年病例居多的干診病房等重點科室，不斷檢出耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌株，成為醫(yī)院感染爆發(fā)流行的重要隱患。了解本院感染細菌的種

4、類與流行特點，清楚耐藥菌株的產(chǎn)生與發(fā)展趨勢及其不同感染來源細菌的同源性分析，不僅可為急重癥感染的及時治療提供保證，還可為醫(yī)院預(yù)防和控制院內(nèi)感染，切斷傳播流行途徑提供科學數(shù)據(jù)資料，為防控策略的制定奠定基礎(chǔ)。另外，神經(jīng)外科作為沈陽陸軍總醫(yī)院手術(shù)量最大的外科科室，術(shù)后患者的顱內(nèi)感染和術(shù)后應(yīng)激狀態(tài)下，腸屏障功能受損引起的炎癥反應(yīng)具有不同于全院整體感染流行狀況的特點。為此，本文對沈陽陸軍總院2014～2016年門診和住院2萬多例患者感染細菌的主要

5、種類和流行概況進行了統(tǒng)計分析;對其中感染頻率較高的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和金黃色葡萄球菌四種重要細菌進行了連續(xù)3個年度12季度的流行與耐藥趨勢研究;對神經(jīng)外科術(shù)后感染的腦脊液細菌的主要種類和流行及耐藥情況進行了觀察研究，對術(shù)后伴有應(yīng)激性潰瘍的患者腸生物屏障的狀況以及早期腸內(nèi)營養(yǎng)對腸道細菌影響進行了分析;對2016年1～3季度不同患者源、不同感染部位源及不同病房源細菌進行了追蹤探討。
　　方法:
　　1.患者

6、來源及標本采集和預(yù)處理:本研究所涉及的患者均來自沈陽陸軍總醫(yī)院自2014年至2016年門診和住院患者。采集的標本包括痰液、血液、引流液等。標本獲取過程中沒有給患者增加額外的經(jīng)濟和身體的負擔，沒有涉及倫理學問題。同時也維護了患者的知情權(quán)。標本的采集均在患者應(yīng)用抗生素之前，根據(jù)感染類型及部位采集相應(yīng)的標本，并遵循嚴格無菌操作方法收集標本。根據(jù)標本類型的不同采取相應(yīng)的常規(guī)預(yù)處理方法。如，血液標本抗凝處理;痰液標本經(jīng)液化離心收取沉淀物;引流液或

7、尿液標本進行離心濃縮;其它組織液或分泌物盡可能低溫和保鮮等。
　　2.細菌分離培養(yǎng)及分純:所有臨床標本接種在相應(yīng)培養(yǎng)基，35℃環(huán)境進行培養(yǎng)18～24小時，次日進行觀察，挑取培養(yǎng)基上可疑的病原菌菌落進行傳代分純，再次進行35℃環(huán)境培養(yǎng)18～24小時。
　　3.細菌的常規(guī)鑒定及藥敏試驗:將3ml無菌鹽水加入到清潔塑料管中，用無菌接種棒挑取血瓊脂培養(yǎng)基或中國藍瓊脂培養(yǎng)基上的菌落接種至鹽水管中，用已校正的Vitek2比濁儀配置制備0

8、.50～0.63麥氏單位的菌懸液。使用相應(yīng)的Vitek2Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)匹配的鑒定及藥敏試驗板卡，按照Vitek2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)說明書進行上機操作。
　　4.脈沖場電泳(PFGE)進行腦脊液肺炎克雷伯菌同源性檢測。膠塊的制備，細胞的裂解，膠塊內(nèi)DNA酶切，加樣電泳，PFGE條帶的解釋，參見Tenover提出的標準。
　　5.D-乳酸、血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白、血二胺氧化酶、腫瘤壞死因子-α檢

9、測采用ELISA法檢測，按試劑盒操作指導程序進行檢測。
　　6.血內(nèi)毒素、血漿C-反應(yīng)蛋白檢測采用光學濁度法檢測與免疫散射比濁法檢測。
　　7.隨機擴增多態(tài)性分析進行同源性檢測:使用DNA提取試劑盒提取DNA，根據(jù)文獻設(shè)計和合成鑒定各種菌的隨機引物，根據(jù)引物退火溫度等特點優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，進行PCR擴增，用毛細管電泳儀法檢測擴增結(jié)果。
　　8.質(zhì)譜鑒定與分析進行同源性檢測:標本復(fù)蘇，血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)處理后，

10、通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)分析鑒定，使用系統(tǒng)軟件MALDI Biotyper對圖譜進行聚類分析，繪制表明親緣關(guān)系的聚類樹狀圖，進行菌株的親緣性分析。
　　9.16S rDNA全序列鑒定進行同源性檢測。細菌基因組DNA的提取，PCR擴增，取各個菌種純化后的PCR產(chǎn)物，使用測序儀ABI3730-XL進行DNA測序。
　　8.統(tǒng)計分析:應(yīng)用NTSYSpc2.1軟件的SAHN對毛細管電泳進行

11、upgma聚類分析。聚類分析的結(jié)果通過Cophenetic correlation評估聚類結(jié)果。應(yīng)用質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)軟件MALDI Biotyper將得到的指紋譜圖和數(shù)據(jù)庫中各種已知微生物的標準指紋圖譜按照匹配程度進行。16S rDNA全序列鑒定結(jié)果用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI ribosomal RNA sequence(Bacteria and Archaea)數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，得到與待菌種序列相似性最大

12、的菌種信息，即為鑒定結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1.病例與標本采集:2014年1月～2016年12月于沈陽陸軍總院共收集標本21609例，其中男性11057例，女性10552例，平均年齡為53±12.55歲。住院患者20540例，門診1069例。
　　2.分離菌株數(shù)量與菌株來源:剔除同一患者同一部位重復(fù)分離菌株，共分離到肺炎克雷伯菌2939株，鮑曼不動桿菌2979株，銅綠假單胞菌2609株，金黃色葡萄球菌1259株，大腸埃

13、希菌1751株，嗜麥芽窄食單胞菌711株，屎腸球菌770株;表皮葡萄球菌809株。
　　3.四種重要細菌的流行病狀況:流行的季節(jié)性分布，2014～2016三年來全醫(yī)院檢出感染細菌種類與數(shù)量見論文一圖1～12。三年的12個季度中，檢出率位于前三位的革蘭氏陰性細菌均為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌。平均檢出率分別為13.8％，13.6％，12.1％;革蘭氏陽性細菌第一位是金黃色葡萄球菌，平均檢出率為5.8％。肺炎克雷伯菌在2

14、014年第3季度和2015年4季度的檢出率分別為當年最高，為19.5％和14.6％，2014年第3季度檢出比例與其他菌相比排在第一位;與肺炎克雷伯菌相似，銅綠假單胞菌同樣在2014年第3季度和2015年4季度的檢出率增加顯著，分別為17.5％和11.8％，2014年第3季度檢出比例也是3年12季度中銅綠假單胞菌檢出率最高的;同時發(fā)現(xiàn)，2014年第3季度和2015年4季度痰標本占比也是同年度最高的，分別為58％和59％;鮑曼不動桿菌201

15、4年第4季度檢測數(shù)量略有下降，為212株，而2015年4季度檢出數(shù)量最多為366株，占比3年來差異不顯著，波動在12.5～14.7％之間;金黃色葡萄球菌在2014年第4季度檢出數(shù)量在3年12個季度中最多，為150株，檢出比例也最高，為8.1％。耐藥及耐藥趨勢分析結(jié)果見論文一圖13～22，表1～10。肺炎克雷伯菌耐藥率最低的亞胺培南和美洛培南兩種藥物的耐藥趨勢2016年顯示明顯增高趨勢，第二季度達到10.2％和16.5％。鮑曼不動桿菌20

16、14年耐藥率最低的是復(fù)方新諾明，但仍為46.1～68％，2015、2016年耐藥呈上升趨勢，波動在58.9～79.2％之間。2015～2016年增加幾種檢測新藥包括替加環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨曲南、頭孢唑啉、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、頭孢曲松、妥布霉素，其中效果最好的替加環(huán)素的耐藥率最低，為1.6～7.6％之間。銅綠假單胞菌的耐藥率最低，敏感率最高的是阿米卡星，耐藥率波動在7.1～14.8％之間，敏感率波動在84.5～90.2％

17、之間。金黃色葡萄球菌在三年期間的耐藥程度比較穩(wěn)定，對利奈唑胺和萬古霉素的敏感性始終為100％，對利福平的敏感性也非常高，波動在87.4～97.8％。
　　4.神經(jīng)外科術(shù)后顱內(nèi)感染腦脊液分離菌株流行狀況:送檢3369人份，陽性標本198人份，陽性率5.88％。前四位分別是鮑曼不動桿菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌。鮑曼不動桿菌對大多數(shù)抗生素均高度耐藥，對替加環(huán)素和阿米卡星敏感率較高，為92％和91％。表皮葡萄球菌敏感的抗

18、生素種類較多，特別是萬古霉素、利奈唑胺、替加環(huán)素敏感率為100％。肺炎克雷伯菌對多數(shù)抗生素耐藥率較高，碳青霉烯類抗生素（亞胺培南與美羅培南）耐藥類也不低，接近20％，阿米卡星耐藥率最低，為9.5％。銅綠假單胞菌對常用抗生素耐藥率較低，頭孢他啶和頭孢吡肟為6.2％，而碳青霉烯類抗生素（亞胺培南與美羅培南）耐藥類達到了30％。
　　5.腦脊液肺炎克雷伯菌PFGE分型:58株產(chǎn)ESBLs菌株經(jīng)XbaⅠ酶切后共產(chǎn)生30條大小不同的片段（圖

19、3），根據(jù)帶型的不同可以分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N共14個類型。其中A型為流行菌株，共21株，包含5個亞型，A1型有17株，A2，A3，A4，A5各一株。B型兩個亞型，B1包含7株，B2包含1株。C型為1株。D型有D1和D2兩個亞型，D1有6株，D2有1株。剩余各型分別為E型4株，F(xiàn)型2株，G型2株，H型3株，I型2株，J型6株，K、L、M、N型各1株
　　6.神經(jīng)外科術(shù)后應(yīng)激狀態(tài)下腸生物屏障細菌移

20、位指標分析:D-乳酸、血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白、血二胺氧化酶、腫瘤壞死因子-α、血內(nèi)毒素、血漿C-反應(yīng)蛋白水平在術(shù)后觀察組高于對照組;腸外營養(yǎng)組高于腸內(nèi)營養(yǎng)組。
　　7.四種臨床分離細菌的菌株同源性分析:患者的自然情況及菌株的來源，患者選自2016年1月至2016年9月期間在沈陽市陸軍總醫(yī)院住院的患者，且同時發(fā)生2個及2個以上部位感染同一種細菌的患者，共獲得上述標準30例，獲得血液、尿液、痰液和腹腔液標本68份?；颊叩男詣e、年齡、標

21、本類型及獲取時間、患者的基礎(chǔ)疾病及其住院科室等信息統(tǒng)計結(jié)果見論文三表17?；颊叻謩e來自急診科、神經(jīng)科、普通外科、肝膽外科和干二病房等臨床科室。其中男22例，女8例，基礎(chǔ)疾病包括尿毒癥、顱腦外傷、心源性休克、高熱待查、黃疸、胸部貫通傷、骨折、膽道梗阻、急性腦梗、腦出血破入腦室、帶狀皰疹、肺炎、肝膿腫、直腸穿孔、糖尿病等。隨機引物PCR擴增及聚類分析結(jié)果（見論文三圖28～31）。分析的28株肺炎克雷伯菌被區(qū)分出4種譜帶群，同一患者不同取材部

22、位在同一聚類群的數(shù)量為9個，占比32.1％。血液、尿液和痰液之間肺炎克雷伯菌的同源關(guān)系比較差異不顯著(P＞0.05);檢測的21株鮑曼不動桿菌被分離出3種明顯的譜帶群，同一患者不同取材部位在同一聚類群的數(shù)量為6個，占比28.6％。血液、尿液和皮下積液之間鮑曼不動桿菌同源關(guān)系比較差異不顯著(P＞0.05);觀察15株銅綠假單胞菌，各菌株間親源關(guān)系區(qū)分不明顯。同一患者不同取材部位譜圖相近的的數(shù)量為14個，占比93.3％;金黃色葡萄球菌可以明

23、顯分出兩種不同的親本的菌株，同一患者不同取材部位譜圖相同，不同的兩名患者感染的菌親源關(guān)系較遠。質(zhì)譜分析與鑒定結(jié)果（見論文三圖53～70，表18～22）:28例肺炎克雷伯菌大致區(qū)分了3個種群，同一患者不同取材部位在同一聚類群的數(shù)量為26個，占比92.9％，21株鮑曼不動桿菌中除樣品B-8-E03、B-2-L01和B-1-M04與其他18株菌的同源性差異較大外，大部分有極高相似度;銅綠假單胞菌質(zhì)譜結(jié)果14例菌株區(qū)分了兩個種群，同一患者不同取

24、材部位的菌型相似度極高;金黃色葡萄球菌的4例樣本，同一患者不同取材部位譜圖相同。
　　8.不同科室間患者感染菌株的同源性:肺炎克雷伯菌的隨機引物擴增和質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致，不同科室內(nèi)檢測到的致病微生物沒有高度同源性;鮑曼不動桿菌的隨機引物擴增和質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致，不同科室內(nèi)檢測到的致病微生物也沒有高度同源性;銅綠假單胞菌的隨機引物擴增和質(zhì)譜鑒定結(jié)果大多數(shù)科室結(jié)果一致，急診科的5株樣品聚類結(jié)果有所差異;金黃色葡萄球菌的質(zhì)譜鑒定結(jié)果和隨機引

25、物擴增結(jié)果表明科室內(nèi)部感染的同源性很高，不同科室內(nèi)之間沒有高度同源性。
　　結(jié)論:
　　1.臨床流行病學調(diào)查結(jié)果表明，沈陽陸軍總院2014至2016年門診和住院患者感染細菌最多的前三位革蘭氏陰性細菌為肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌;革蘭氏陽性細菌第一位是金黃色葡萄球菌;感染細菌的流行季節(jié)分析證明，夏季肺炎克雷伯菌檢出率較高;四種細菌的耐藥性分析結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率增高，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷

26、伯菌對碳青霉烯等藥物的耐藥率反而較總體水平偏低，鮑曼不動桿菌的耐藥性一直偏高并且有逐步上升趨勢。
　　2.神經(jīng)外科術(shù)后顱內(nèi)感染患者腦脊液流行分析顯示，以革蘭氏陰性桿菌為主，鮑曼不動桿菌對大多數(shù)抗生素均高度耐藥;沈陽陸軍總院神經(jīng)外科病房存在著同源性的肺炎克雷伯菌菌株，可能會引起院內(nèi)肺炎克雷伯菌感染的爆發(fā)流行。
　　3.神經(jīng)外科術(shù)后應(yīng)激狀態(tài)下腸屏障細菌移位指標結(jié)果顯示，應(yīng)激狀態(tài)下存在腸屏障功能損傷，導致細菌移位。早期腸內(nèi)營養(yǎng)對腸

27、屏障功能損傷有治療作用。
　　4.不同患者及不同部位感染菌株的同源性分析發(fā)現(xiàn)，用隨機引物擴增的方法聚類分析同一患者不同感染部位分離的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的同源性很高，用質(zhì)譜方法鑒定源于同一患者不同感染部位的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的同源性較高，鮑曼不動桿菌個體感染的同源性不顯著。用16S rDNA全序列鑒定提示鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌同源性很高。
　　5.不同科室間感染菌株的同源性分析結(jié)果揭示，自