甜瓜14-3-3家族和NPR1-like基因克隆及功能分析.pdf

1、NPR1(nonexpressor of pathogenesis-related genes1)基因可參與植物的廣譜抗性，在植物系統(tǒng)抗性中起著關(guān)鍵作用。14-3-3蛋白是一類普遍存在于真核生物中高度保守的調(diào)節(jié)蛋白，它通過與靶蛋白的相互作用，參與生物體內(nèi)的基本代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、光周期、生物脅迫、非生物脅迫等多種調(diào)控過程，是生物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)蛋白。本文以甜瓜為材料，分別克隆了甜瓜NPR1-like基因和14-3-3家族全體成員，用

2、qRT-PCR技術(shù)分析其在激素、生物逆境及非生物逆境下的表達(dá)模式，并通過在本氏煙中過表達(dá)CmNPR3和CmNPR4基因研究其與植物抗病性的關(guān)系。
　　甜瓜14-3-3家族和NPR1-like基因的克隆及亞細(xì)胞定位:利用RT-PCR技術(shù)克隆鑒定了來自甜瓜14-3-3家族的9個(gè)基因和2個(gè)NPR1-like基因（CmNPR3/CmNPR4），并對其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，14-3-3家族9個(gè)成員在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有分布，而Cm

3、NPR3和CmNPR4蛋白則全部定位于細(xì)胞核中。
　　14-3-3家族成員、CmNPR3/CmNPR4的蛋白互作分析:分別將14-3-3家族基因構(gòu)建到BiFC載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)注射侵染本氏煙，激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，該家族成員之間及其自身都能進(jìn)行互作，形成同源或者異源二聚體。利用同樣方法我們也對CmNPR3/CmNPR4進(jìn)行互作驗(yàn)證，結(jié)果顯示這兩個(gè)蛋白自身以及之間也均能進(jìn)行互作，并且不依賴于SA的誘導(dǎo)。這一結(jié)果在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中得到

4、了進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　14-3-3家族成員和CmNPR3/CmNPR4基因在非生物逆境和激素處理下表達(dá)模式分析:對甜瓜植株分別進(jìn)行激素處理(SA/JA/ACC)和非生物逆境脅迫處理（冷、熱、鹽、干旱）。結(jié)果顯示，在SA處理下，CmNPR3/CmNPR4基因表達(dá)明顯上調(diào)，其余激素處理下基因表達(dá)變化不明顯。干旱脅迫和熱脅迫下14-3-3家族部分成員基因表達(dá)明顯下調(diào)。
　　CmNPR3和CmNPR4基因正調(diào)控植物對病原菌抗性。通過

5、農(nóng)桿菌注射在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)CmNPR3和CmNPR4基因，兩天后接種灰霉病菌（Botrytis cinerea）和Pst DC3000（Pseudomonas syringae pv.tomato），結(jié)果顯示，接種Pst DC3000后，過表達(dá)CmNPR3和CmNPR4基因的植株與對照植物相比發(fā)病較輕，葉片上病斑較小，說明CmNPR3和CmNPR4基因在植株抵抗細(xì)菌侵染過程中有積極作用，而在接種灰霉病菌的實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)植株與對照組無明