日本血吸蟲23kDa膜蛋白(Sj23)和脂肪酸結(jié)合蛋白(Sj14)的雙價DNA疫苗免疫保護性研究.pdf

1、日本血吸蟲病是一種廣泛流行的人獸共患寄生蟲性疾病，導致嚴重的發(fā)病率和死亡率。盡管有一些抗血吸蟲病的藥物和公共衛(wèi)生控制措施，血吸蟲病并沒有被控制，局部地區(qū)仍在擴散。在大多數(shù)病例中化療能有效控制血吸蟲病的病程發(fā)展，但流行區(qū)病人迅速的再感染需要反復的化療。這不僅增加治療成本，而且有引起耐藥性的危險。因此，研制安全有效血吸蟲病疫苗是長期綜合防治血吸蟲病的重要措施之一。
　　 自1990年Wolff 報道編碼外源蛋白的質(zhì)粒DNA注射到小鼠

2、的骨骼肌，外源蛋白能在骨骼肌中持續(xù)穩(wěn)定的表達以來，抗血吸蟲病疫苗進入核酸疫苗的新階段。核酸疫苗相對于傳統(tǒng)的致弱疫苗和亞單位疫苗具有低成本，熱穩(wěn)定性和能誘導廣泛的體液和細胞免疫反應等優(yōu)點。人們陸續(xù)制備出許多單價DNA疫苗，盡管可以產(chǎn)生特異性抗體和細胞毒性T淋巴細胞反應，但與致弱尾蚴產(chǎn)生的高保護力相比，單價DNA疫苗的免疫保護效果并不令人滿意，至今還沒有一商品化的疫苗問世。究其原因血吸蟲是多細胞生物,基因組比細菌病毒復雜得多，且在與宿主長期

3、進化的過程中產(chǎn)生了多種免疫逃避機制，所以單一的疫苗難以誘導出足夠有效的保護力抵御攻擊感染。發(fā)展多價疫苗是提高保護力的新策略，它具有多個保護性表位分子，能針對血吸蟲不同種株和生活史中不同階段的特異性抗原產(chǎn)生較好的保護力。
　　 本研究將不同的日本血吸蟲抗原分子23kDa膜蛋白(Sj23)和脂肪酸結(jié)合蛋白(Sj14)引入到同一真核表達載體pVIVO2-mcs，構(gòu)建雙價共表達核酸疫苗，以期提高免疫保護效果。以BALB/c小鼠為動物模型

4、觀察了單價疫苗，共表達、融合表達雙價疫苗、雞尾酒混合雙價核酸疫苗和四價疫苗的免疫保護效果，并初步以免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、末次免疫后攻擊感染的時間四個因素探討了雙價疫苗的免疫優(yōu)化方案。
　　 研究工作分為以下四個部分:
　　 一．日本血吸蟲Sj23與Sj14的雙價共表達DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14)的構(gòu)建和鑒定
　　 以pVIVO2-IL12

5、-Sj23和 pVIVO2-IL12-Sj14為模板,根據(jù)Sj23、Sj14基因序列各設計2對引物，用PCR技術得到Sj23和Sj14的DNA片段。將這兩個片段分別插入到真核表達載體pVIVO2-mcs的一個多克隆位點(BamHI/EcoRI),構(gòu)建兩個單價DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj14。與此類似，用含有不同酶切位點的另一對引物通過PCR技術得到Sj23和Sj14的DNA片段，經(jīng)酶切后插入單價疫

6、苗的另一個位點(AvrII/BspHI)上，構(gòu)建雙價DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14，酶切分析鑒定陽性克隆，并進行序列測定。結(jié)果：雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-Sj14、pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23，所得小片段的大小分別是440bp和710bp。測序結(jié)果顯示插入的cDNA片段與公布的

7、Sj23或Sj14片段序列一致，提示質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 華中科技大學生命科學院利用重組PCR技術將日本血吸蟲Sj14和Sj23的基因片段用(Gly4Ser)3進行連接,得到融合基因Sj14·Sj23和Sj23·Sj14,再將該片段重組于pVIVO2-mcs載體多克隆位點(BamHI/EcoRI)中,成功構(gòu)建兩種融合雙價DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14，pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23。與此類似，用含有

8、不同酶切位點的另一對引物通過PCR技術得到融合基因Sj14·Sj23和Sj23·Sj14，經(jīng)酶切后插入雙價疫苗的另一個位點(AvrII/BspHI)上，成功構(gòu)建兩種四價DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14/Sj14·Sj23，pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23/Sj23·Sj14。將pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14以等量混合，獲得雞尾酒混合疫苗。
　　 選用的

9、載體pVIVO2-mcs是Invivogen公司新一代的具有兩個翻譯單位的雙基因真核表達載體，由于真核表達載體具有人鐵蛋白FerL和 FerH復合啟動子，可以消除兩個轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄干擾。兩個啟動子的活性可進一步被SV40和CMV增強子增強。
　　 二．日本血吸蟲Sj23與Sj14的雙價共表達DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23)的真核表達
　　 在進行動物免疫接種前，必須確定構(gòu)建的DNA質(zhì)粒能夠在真核細胞

10、合成表達相應的目的抗原分子。為此，選取雙價共表達DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23，觀察其在體內(nèi)外的真核表達。
　　 1．質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23的體外瞬時表達采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術將質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs進行體外瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，轉(zhuǎn)染后48小時通過RT-PCR檢測Sj14和Sj23 mRNA的表達，以間接免疫熒光法檢測相應蛋白的表達。

11、　　 RT-PCR結(jié)果顯示pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23轉(zhuǎn)染后獲得了440bp和710bp兩條目的條帶，間接免疫熒光染色顯示部分轉(zhuǎn)染細胞的胞膜和胞漿中有目的蛋白的表達。表明上述重組質(zhì)粒能夠在哺乳動物細胞中表達。
　　 2．質(zhì)粒pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23在BALB/c小鼠體內(nèi)骨骼肌細胞的表達及持續(xù)時間18只BALB/c小鼠隨機分為兩組，分別以pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23和pVIVO2-mcs質(zhì)

12、粒100μg/只經(jīng)股四頭肌免疫，免疫后4周、8周、12周、16周、20周、24周分別處死小鼠，取注射側(cè)股四頭肌做冰凍切片，間接免疫熒光定位顯示免疫小鼠肌細胞的胞膜和胞漿均獲得目的蛋白的表達，且表達持續(xù)6個月以上。
　　 三.DNA疫苗免疫保護力的觀察
　　 120只5周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為12組,每組小鼠分別肌肉免疫下述DNA各100μg：pVIVO2-mcs，pVIVO2-mcs-Sj23，pVIVO2-mc

13、s-Sj14，pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14，pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23，pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14，pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23，pVIVO2-mcs-Sj23·Sj14/Sj14·Sj23，pVIVO2-mcs-Sj14·Sj23/Sj23·Sj14，pVIVO2-Sj23/Sj14+香菇多糖(100μg)，雞尾酒式混合疫苗(pVIVO2-mcs-Sj23/Sj14與pVIVO2-m

14、cs-Sj23.Sj14各50μg)，對照組各鼠免疫生理鹽水100μl。免疫后4周，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染40±2條日本血吸蟲尾蚴，感染后6周剖殺，收集成蟲計算蟲荷均數(shù)并計算每克肝組織的蟲卵數(shù)(EPG)。用TY70圖像分析系統(tǒng)，測量肝臟切片中單卵肉芽腫直徑(μm)，以減蟲率、肝減卵率和單個蟲卵肉芽腫直徑減小率評價各組質(zhì)粒免疫保護力。
　　 四．日本血吸蟲Sj23與Sj14的雙價共表達DNA疫苗(pVIVO2-mcs-Sj14/S

15、j23)免疫優(yōu)化方案的研究
　　 為探討最佳免疫條件，選取雙價DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23進行第二次動物試驗。應用SPSS12.0軟件設計四因素三水平的免疫正交方案，通過統(tǒng)計學方法，以最少的實驗組數(shù)獲得與設置所有實驗組相近的結(jié)果。
　　 本課題研究初步得出以下結(jié)論：
　　 1．成功構(gòu)建兩種單價DNA疫苗pVIVO2-mcs-Sj23，pVIVO2-mcs-Sj14和兩種共表達雙價DNA疫苗p

16、VIVO2-mcs-Sj23/Sj14和pVIVO2-mcs-Sj14/Sj23。
　　 2．雙價DNA疫苗可以在體內(nèi)外表達，且體內(nèi)表達持續(xù)時間至少在6個月以上。
　　 3．適宜佐劑可增強抗原免疫力和維護免疫的回憶性效應，首次提出香菇多糖是DNA疫苗有效的佐劑，取得很好的結(jié)果，值得進一步研究。
　　 4．為提高DNA疫苗保護力，我們首先采用多價多位點的技術路線，以共表達、融合表達和雞尾酒混合三種形式構(gòu)建雙價DNA

17、疫苗，均可誘導小鼠產(chǎn)生較顯著的抗血吸蟲攻擊感染的免疫保護力(有五組減蟲率超過50[％]),保護作用顯著高于單價DNA疫苗，無疑在多價疫苗的設計上提供了新的思路和依據(jù)。
　　 5．為提高DNA疫苗保護力，從免疫劑量、免疫次數(shù)、免疫途徑、末次免疫后攻擊感染時間四個因素個三個水平，探索和研究免疫優(yōu)化方案。在統(tǒng)計學上，四個因素三個水平無顯著性差異，但傾向于此范圍內(nèi)：50μg、免疫2次、皮內(nèi)免疫和免疫12周后攻擊感染為本次試驗的最佳免疫方