日本血吸蟲Sj16重組蛋白免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、日本血吸蟲病(Schistosoma japonicum)是嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，目前主要在中國、菲律賓和印度尼西亞等國流行。在中國，防治血吸蟲病仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題。至2007年底，尚有7個省、市、自治區(qū)的105個縣流行血吸蟲病，血吸蟲感染者仍有將近67萬例；此外，歷史上無螺區(qū)和一些基本消滅血吸蟲病的地區(qū)，疫情出現(xiàn)反彈，血吸蟲病患者及釘螺面積均有回升趨勢；因此，我國現(xiàn)階段血吸蟲病防治任務(wù)仍然艱巨。我國血吸蟲病防治

2、的主要措施包括滅螺(預(yù)防傳播)和吡喹酮人群化療(控制發(fā)病)。但是滅螺受自然環(huán)境的限制措施難以全面實(shí)施，而吡喹酮化療也存在耐藥性產(chǎn)生的潛在危險(xiǎn)及再感染問題。為此，血吸蟲病疫苗的研制和可能使用被認(rèn)為是控制血吸蟲病流行的可持續(xù)性措施。盡管血吸蟲病疫苗研究已經(jīng)有80多年的歷史，但是目前尚未找到一個真正有價(jià)值的疫苗，其原因很多，其中，人們?nèi)狈υ诜肿铀缴蠈ρx生物學(xué)特性的全面認(rèn)識，以及缺乏對其免疫逃避機(jī)制的全面認(rèn)識是其中一個重要的原因。

3、 免疫逃避這個概念是Paul Ehrlich在研究非洲錐蟲時提出的，他發(fā)現(xiàn)非洲錐蟲感染宿主后其自身抗原性發(fā)生改變。這個概念提出以后，有關(guān)寄生蟲免疫逃避機(jī)制的研究受到科學(xué)者的廣泛關(guān)注，并取得了一定的進(jìn)展。但從總體上看，這種認(rèn)識仍然十分有限。研究發(fā)現(xiàn)，血吸蟲免疫逃避的存在可能使疫苗誘導(dǎo)保護(hù)力或宿主保護(hù)性應(yīng)答降低，甚至完全無效。因此，對血吸蟲免疫逃避機(jī)制的研究有著非常重要的意義，而且是一個需要從根本上解決的問題。研究資料已經(jīng)證實(shí)，血吸蟲尾蚴經(jīng)

4、皮膚侵入終宿主轉(zhuǎn)化為童蟲，首先在皮下停留2-3h，在此過程中血吸蟲只引起皮膚的輕微炎癥反應(yīng)，而死的血吸蟲尾蚴或皮內(nèi)注射死蟲的提取物卻可以引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。這一現(xiàn)象提示，活的血吸蟲可能分泌了一種能抑制炎癥反應(yīng)的物質(zhì)。1996年，Ramaswamy K等從曼氏血吸蟲的分泌物中找到一種分子量為16.8kDa的蛋白質(zhì)，并將其命名為Sm16。隨后研究發(fā)現(xiàn)，Sm16可以在體外抑制抗原介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖和脾臟及皮膚淋巴結(jié)IL-2的產(chǎn)生、抑制人類角質(zhì)

5、細(xì)胞IL-1的表達(dá)、抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1；當(dāng)Sm16被注射入真皮內(nèi)，可降低LPS對中性粒細(xì)胞的趨化作用。其后的更多研究都證實(shí)Sm16為一種免疫調(diào)節(jié)分子，可能與血吸蟲逃避宿主對其的免疫應(yīng)答有關(guān)。在分析曼氏血吸蟲Sm16研究文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室從1999年開始對sj16-Sm16同源物蛋白進(jìn)行了一系列的研究，包括基因的克隆、重組表達(dá)及其活性鑒定。結(jié)果初步表明：Sj16與Sm16一樣具有免疫調(diào)節(jié)作用，是一種具有潛在開發(fā)價(jià)值的蟲源性免

6、疫調(diào)節(jié)活性分子，值得進(jìn)一步的研究。研究目的和意義在已有工作基礎(chǔ)上，本課題重點(diǎn)開展日本血吸蟲sj16重組蛋白(resj16)的生物學(xué)和免疫學(xué)特性研究，從而進(jìn)一步揭示sj16的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，并為尋找有別于現(xiàn)有免疫抑制劑作用機(jī)制的、原創(chuàng)性新型免疫抑制劑／藥物提供科學(xué)依據(jù)，為利用蟲源型活性物質(zhì)的特有生物學(xué)特性，開發(fā)和研制創(chuàng)新性免疫類藥物／生物制劑提供新的思路。本研究也將進(jìn)一步豐富血吸蟲免疫逃避研究的信息，并為血吸蟲病疫苗研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

7、 研究結(jié)果 1、sj16的序列結(jié)構(gòu)特征 sj16基因具有完整的開放讀碼框，含有一段54bp的信號肽序列，其ORF從第30位到第380位共351bp，編碼117個氨基酸的蛋白質(zhì)，理論分子量是13.65KDa，其等電點(diǎn)pI=9.02。sj16氨基酸序列中除含有1個信號肽序列外，還有1個跨膜區(qū)域，兩者的結(jié)構(gòu)域都存在N端部分，分別為1aa-16aa和5aa-25aa。二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Si16共擁有2個潛在的蛋白激酶C(PKC

8、)磷酸化位點(diǎn)，2個潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn)，1個酪氨酸激酶(TYR)磷酸化位點(diǎn)，1個N-myristoylation位點(diǎn)，1個潛在的酰胺位點(diǎn)，但這兩個半胱氨酸(Cys)都不形成二硫鍵。存在一個潛在的跨膜區(qū)域，其N端在膜內(nèi)。同源性分析表明其與曼氏血吸蟲SPO-1(登錄號：AF109180)、曼氏血吸蟲抗炎蛋白16即Sm16(登錄號：AF269252_1)同源性最高，提示其可能與Sm16功能類似。 2、sj16的生物學(xué)

9、特性 半定量RT-PCR結(jié)果顯示，日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、童蟲、雄蟲、雌蟲mRNA中在351bp處均有一明顯條帶，同時管家基因β-actin在各個階段中均有表達(dá)，證明Sj16基因在日本血吸蟲各個生活史階段中均有明顯表達(dá)。 成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-sj16重組質(zhì)粒，并進(jìn)行了原核表達(dá)，15％SDS-PAGE結(jié)果顯示在分子量約40kDa處，菌體超聲裂解上清中有相應(yīng)的表達(dá)條帶，表明可溶性表達(dá)獲得成功，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化，

10、獲得純度較高的目的蛋白。目的蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定確定為sj16。 尾蚴蟲體免疫熒光檢測結(jié)果顯示，sj16大致分布于尾蚴頭腺、鉆腺附近部位，而在尾蚴尾部及體部其他部位沒有明顯分布。 成蟲免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)，sj16主要分布于蟲體內(nèi)部組織和腔道中，在表膜中沒有分布。但其具體的組織定位尚有待于進(jìn)一步研究。 3、reSj16免疫學(xué)特性 3.1 reSj16能調(diào)節(jié)宿主炎癥反應(yīng)不同劑量的reSj16(1，5，10μg／kg)

11、均可以明顯減輕二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和毛細(xì)血管通透性增加，抑制角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹，明顯抑制實(shí)驗(yàn)性腹膜炎小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高，且具有一定的劑量依賴關(guān)系。 3.2 reSj16對小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(DC)的作用分離和培養(yǎng)BMDC，通過光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡鑒定發(fā)現(xiàn)，具有典型的DC形態(tài)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測具有典型的DC表面標(biāo)記形態(tài)。通過AffinityPakTMDetoxi-GelTMEndotoxin Removing

12、 Gel處理后，reSj161mg／ml內(nèi)毒素含量小于0.2EU／Kg，符合《美國FDA終產(chǎn)品檢測指南》中關(guān)于生物制品中內(nèi)毒素含量的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，未成熟的BMDC經(jīng)LPS1.0μg／ml刺激24h以后，其DC表面標(biāo)記CD40、CD80、CD86、CD11c和MHCⅡ類分子的表達(dá)水平較對照組有明顯的提高。而經(jīng)過reSj16預(yù)先處理組的DC與LPS刺激組相比，DC表面標(biāo)志CD40、CD80、CD86和MHCⅡ各分子的表達(dá)

13、均顯著減少(P<0.05)，尤其是MHC-Ⅱ分子降低最明顯，而對CD11c的影響相對不明顯。 混合淋巴實(shí)驗(yàn)表明，LPS1.0μg／ml刺激的BMDC誘導(dǎo)異基因T淋巴細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)，顯著高于對照組，而0.1、0.5、1.0μg／ml reSj16處理組的BMDC誘導(dǎo)異基因T淋巴細(xì)胞增殖的能力較LPS對照組顯著減低，甚至低于正常對照組。 利用reSj16刺激成熟BMDC表明，0.1、0.5、1.0μg/ml reSj16

14、刺激12h、24h，Si16處理組Annexin V+／PI-細(xì)胞、Annexin、V+／PI+細(xì)胞相比對照組有一定的降低，且有一定的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)reSj16 0.1、0.5、1.0μg/ml刺激48h后，reSj16處理組Annexin V+／PI+細(xì)胞的數(shù)目均較對照組有所上升，接近對照組或略高于對照組，但是Annexin V+／PI-細(xì)胞仍較對照組為低；刺激72h后，各Sj16處理組細(xì)胞AnnexinV+／PI-明顯增多，接近對

15、照組或略高于對照組，Annexin V+／PI-細(xì)胞較對照組明顯增多。 研究小結(jié) 1、Sj16編碼基因ORF全長351bp，編碼117個氨基酸。與曼氏血吸蟲Sm16的氨基酸序列一致性高達(dá)96％，可能具有與Sm16類似的免疫調(diào)節(jié)功能。該分子在日本血吸蟲蟲卵、尾蚴、童蟲、雌蟲、雄蟲中均有表達(dá)，無階段特異性。該蛋白為分泌蛋白，組織學(xué)定位于尾蚴蟲體頭腺和鉆腺處和成蟲內(nèi)部組織和腔道內(nèi)。 2、成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-S

16、j16原核表達(dá)載體，細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出重組融合蛋白，利用親和層析方法獲得具有生物學(xué)活性的純化reSj16重組蛋白，并經(jīng)過SDS-PAGE和質(zhì)譜的鑒定。 3、不同劑量的reSj16(1，5，10μg／kg)均可以顯著減輕二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和毛細(xì)血管通透性增加，抑制角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹，抑制實(shí)驗(yàn)性腹膜炎小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高和抑制硫膠質(zhì)所致小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的滲出，且具有一定的劑量依賴關(guān)系。表明reSj16具

17、有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。 4、reSj16體外刺激小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，相比于LPS陽性對照組，其DC表面標(biāo)志CD40、CD80、CD86和MHCⅡ各分子的表達(dá)均明顯減少，而對CD11c的影響相對不是非常明顯。reSj16刺激以后，MHC-Ⅱ、共刺激分子和黏附分子等表達(dá)的降低必然影響DC功能的發(fā)揮，故推測reSj16對DC功能的影響可能是其引起免疫下調(diào)的一個可能的機(jī)制。而混合淋巴實(shí)驗(yàn)表明reSj16刺激的BMDC誘導(dǎo)同種異基因