丹紅注射液聯(lián)合脂肪干細(xì)胞移植改善糖尿病裸鼠后肢缺血血管新生的研究.pdf

1、研究背景：
　　 脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)，由于其取材便捷、移植后免疫排斥弱等優(yōu)勢(shì)，作為治療性血管新生的種子細(xì)胞，大量應(yīng)用于缺血性疾病的基礎(chǔ)研究和臨床干預(yù)。然而，缺血性疾病多伴有糖尿病、冠心病、高血壓等慢性疾病，機(jī)體“三高”導(dǎo)致干細(xì)胞歸巢及存活率下降，嚴(yán)重影響其臨床療效。尤其是機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下，可導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end pro

2、ducts，AGEs)生成增多，引起氧化應(yīng)激和促炎反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體干細(xì)胞難以動(dòng)員修復(fù)受損內(nèi)皮，體外移植的干細(xì)胞也難以歸巢、存活。中醫(yī)“生脈”理論與治療性血管新生密切相關(guān)，大量研究結(jié)果顯示，經(jīng)典活血化瘀方——丹紅注射液（Danhong injection，DH）能顯著改善缺血性疾病瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)等癥狀。
　　 研究目的：
　　 本課題通過(guò)體外干預(yù)ADSCs，觀察AGEs中重要的亞型之一——Nε羧甲基賴氨酸修飾白蛋白

3、(Nε-(carboxymethyl) Lysine albumin，CMLs)對(duì)ADSCs功能及血管新生作用的影響及DH的保護(hù)作用;同時(shí)，在糖尿病裸鼠后肢缺血模型上，聯(lián)合使用DH和ADSCs移植，觀察其對(duì)模型動(dòng)物后肢血流灌注及血管管樣生成的影響，并結(jié)合VEGF/H2S正反饋環(huán)的生物學(xué)作用探索其可能機(jī)制。為進(jìn)一步完善中醫(yī)藥聯(lián)合干細(xì)胞移植促進(jìn)缺血性疾病血管新生的理論體系和為臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1

4、、ADSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:用酶消結(jié)合差速離心法分離人皮下脂肪組織的間質(zhì)細(xì)胞，用含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)以及集落形成時(shí)間。待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80％融合，用胰酶消化法傳代擴(kuò)增。鑒定方法包括光鏡下形態(tài)學(xué)觀察，不同方案誘導(dǎo)細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨分化潛能的鑒定。
　　 2、CML-BSA對(duì)ADSCs功能及血管新生作用的影響及DH的保護(hù)作用:細(xì)胞匯聚80

5、％后采用DMEM/F12空培養(yǎng)基同步化24小時(shí)，再分別加入不同干預(yù)液。干預(yù)液共分為5組:PBS空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組BSA(60μg/ml)、CML-BSA(60μg/ml)組、DH(100μl/ml)組、CML-BSA（60μg/ml）+DH(100μl/ml)干預(yù)組。干預(yù)24小時(shí)后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，采用WST-1試劑盒檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖情況的影響;采用 Caspase-Glo3/7檢測(cè)試劑盒和流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/P

6、I雙染檢測(cè)試劑盒檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡水平的影響;采用transwell小室檢測(cè)對(duì)細(xì)胞遷移功能的影響;采用人VEGF的ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞分泌VEGF的影響。并通過(guò)體外Matrigel凝膠血管新生實(shí)驗(yàn)，觀察其血管新生能力的變化情況的影響。同時(shí)，采用反向高效液相色譜(ReversePhase High-Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)聯(lián)合熒光檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞生成硫化氫(Hydrogen Su

7、lfide，H2S)的量，采用Real-time PCR檢測(cè)H2S合成酶CSE的變化。
　　 3、構(gòu)建糖尿病裸鼠下肢缺血模型:采用一次性腹腔注射鏈脲霉素(streptozotocin，STZ)150mg/kg，2次隨機(jī)血糖≥16mmol/l為模型制備成功。隨后，分離糖尿病裸鼠左下肢股動(dòng)脈，上游結(jié)扎點(diǎn)為旋髂動(dòng)脈、股深動(dòng)脈和股動(dòng)脈分支處，下游結(jié)扎點(diǎn)為齊平膝關(guān)節(jié)處，并離斷該段股動(dòng)脈，術(shù)后采用激光多普勒血流灌注掃描儀(Laser Dop

8、plerperfusion imager system，LDPI)觀察下肢血流灌注情況。
　　 4、DH聯(lián)合ADSCs移植對(duì)糖尿病裸鼠后肢缺血血管新生的影響:將40只裸鼠隨機(jī)分為糖尿病后肢缺血對(duì)照組(n=10)、糖尿病后肢缺血+ADSCs（1×106個(gè)/只）移植組(n=10)、糖尿病后肢缺血+ DH（2μl/g×7天，腹腔注射）組(n=10)及糖尿病后肢缺血+ DH聯(lián)合ADSCs移植組(n=10)，2周后，通過(guò)LDPI觀察血流灌

9、注情況，X線動(dòng)脈造影觀察血管管樣生成情況;制備缺血下肢肌肉橫切面石蠟切片，采用HE染色和CD31免疫組化染色，觀察微血管新生情況。同時(shí)，鼠VEGF的ELISA試劑盒檢測(cè)下肢組織勻漿上清中VEGF的量;采用Real-Time PCR儀分析裸鼠下肢組織勻漿VEGF、CSE mRNA的相對(duì)表達(dá)量的變化;采集缺血下肢股靜脈血，通過(guò)RP-HPLC聯(lián)合熒光檢測(cè)法檢測(cè)H2S的量。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、ADSCs鑒定:①形態(tài)學(xué)觀

10、察:接種培養(yǎng)6小時(shí)后細(xì)胞開(kāi)始貼壁樣生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，3天后，可見(jiàn)有集落形成，細(xì)胞極性生長(zhǎng)呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣外形;②誘導(dǎo)細(xì)胞成脂、成骨、成軟骨分化:用胰島素聯(lián)合3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)干預(yù)ADSCs，經(jīng)油紅O染色鑒定，顯示ADSCs向脂肪分化;β-甘油磷酸鈉和地塞米松干預(yù)ADSCs，經(jīng)茜素紅染色鑒定，細(xì)胞向骨細(xì)胞分化;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth

11、 factor-beta，TGF-β)和胰島素干預(yù)ADSCs，經(jīng)阿爾新藍(lán)染色鑒定，可誘導(dǎo)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。
　　 2、CML-BSA對(duì)ADSCs功能及血管新生作用的影響及丹紅注射液的保護(hù)作用:與BSA對(duì)照組相比，CML-BSA能顯著抑制ADSCs增殖和遷移的能力，增加ADSCs凋亡，減少VEGF的分泌和內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生，降低CSE mRNA的表達(dá)(P＜0.05);與PBS對(duì)照組相比，DH能顯著促進(jìn)ADSCs增殖和遷移的能力，

12、抑制其凋亡，增加VEGF的分泌(P＜0.05)，促進(jìn)內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生及其合成酶CSE mRNA的表達(dá)(P＞0.05);且DH能部分改善CML-BSA的負(fù)性作用(P＜0.05)。
　　 3、糖尿病裸鼠下肢缺血模型鑒定:①STZ腹腔注射后血糖監(jiān)測(cè):STZ腹腔注射2周后，采用剪尾法測(cè)外周血糖值為20.33±1.93mmol/1，各組間血糖值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，40只裸鼠血糖值均高于16mmol/l，糖尿病造模成功率為100％。隨后，結(jié)

13、扎并分離裸鼠左下肢股動(dòng)脈，左下肢為假手術(shù)，術(shù)后采用LDPI觀察下肢血流灌注情況，采用LDPIwin3.1軟件分析左下肢血流灌注量明顯低于右下肢血流灌注量(p＜0.05)，各組間血流灌注值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=10，p＞0.05)。
　　 4、DH聯(lián)合ADSCs移植對(duì)糖尿病裸鼠后肢缺血血管新生的影響:與對(duì)照組相比，單純ADSCs移植和單純DH腹腔注射，均能明顯增加血流灌注比率(P＜0.05)，X線造影結(jié)果顯示管樣形成明顯增加(P＜

14、0.05)，促進(jìn)裸鼠機(jī)體合成和分泌VEGF(P＜0.05)，升高缺血組織內(nèi)源性H2S的生成(P＜0.05)，其合成酶CSE mRNA的表達(dá)亦明顯升高(P＜0.05); HE染色和CD31免疫組化染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，單純ADSCs移植和單純DH腹腔注射明顯增加微動(dòng)脈管徑和管壁面積，促進(jìn)微動(dòng)脈新生(P＜0.05)。與其余3組比較，DH聯(lián)合ADSCs移植對(duì)后肢缺血具有協(xié)同保護(hù)作用，療效更佳(P＜0.05)。
　　 研究結(jié)論：<

15、br>　　 1、CML-BSA能抑制ADSCs的增殖、遷移和分泌VEGF的能力，促進(jìn)其凋亡，抑制ADSCs血管新生功能;DH能促進(jìn)ADSCs的增殖、遷移和分泌VEGF的能力，抑制其凋亡，促進(jìn)其血管新生能力。DH能部分改善CML-BSA的負(fù)性作用。其機(jī)制可能與內(nèi)源性H2S系統(tǒng)的活化有關(guān)。
　　 2、單獨(dú)給予ADSCs移植或DH腹腔注射，均能改善糖尿病裸鼠后肢缺血血流灌注，促進(jìn)血管管樣生成，擴(kuò)張缺血組織的肌間動(dòng)脈，增加微血管密度，