分泌澀柿單寧酶的微生物篩選及其酶特性的研究.pdf

1、柿(Diospyros kaki Lf．)是一種營養(yǎng)成分豐富的水果。含有糖類、人體必須的氨基酸、多種微量元素、維生素、有機酸、黃酮類等。我國柿資源豐富，栽培面積達293.8公頃，年總產(chǎn)量為3469.4千噸，占世界總產(chǎn)量的70％以上。我國生產(chǎn)的柿約有80％是澀柿，脫澀后柿果在加工過程中或加工后出現(xiàn)的返澀現(xiàn)象，至今在生產(chǎn)實踐中仍沒有科學(xué)、有效的解決方法，嚴重制約了澀柿加工的工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。傳統(tǒng)的脫澀方法澀柿脫澀后并非單寧物質(zhì)消失，只

2、是因為單寧溶解度降低，與口腔中蛋白質(zhì)的結(jié)合能力降低，人感覺不到澀味。本論文以解決澀柿返澀問題為出發(fā)點，尋找可以分泌單寧酶的微生物，分解澀柿單寧，從根本上解決澀柿返澀問題。這對推動柿產(chǎn)業(yè)發(fā)展、增加柿果的附加值，提高經(jīng)濟效益有重要的實踐指導(dǎo)意義。 本文從創(chuàng)造模擬環(huán)境入手，以澀柿作為微生物生長的微環(huán)境，讓微生物自然生長，利用平板劃線法分離微生物，獲得純種菌株。通過菌株在溴酚蘭培養(yǎng)基中的變色情況、COD去除率以及菌株對單寧耐受力，篩選出

3、目標菌株。通過對菌落形態(tài)觀察和水浸片的觀察，初步鑒定目標菌株為黑曲霉(A.niger)。 對目標菌株的原生質(zhì)體進行紫外誘變，測定誘變菌株產(chǎn)酶能力及傳代穩(wěn)定性，篩選出試驗菌株。通過單因素試驗和L<,27>(3<'13>)正交試驗，研究了培養(yǎng)時間、溫度、初始pH值、葡萄糖濃度、接種量、澀柿單寧含量、容器裝液量等因素，確定該誘變菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)工藝參數(shù)。最后對黑曲霉單寧酶的特性進行探討。研究結(jié)果如下： (1)28℃，160r/m

4、in搖床中，黑曲霉恒溫培養(yǎng)72h可獲得較大生物量和最高產(chǎn)酶能力。 (2)160r/min搖床中恒溫培養(yǎng)72h，黑曲霉產(chǎn)酶的適宜溫度為28～32℃，其中30℃時黑曲霉所產(chǎn)單寧酶活力最高為142.9U/mL。 (3)30℃，160r/min搖床中恒溫培養(yǎng)72h，黑曲霉產(chǎn)單寧酶的適宜澀柿單寧濃度為2～5％。澀柿單寧濃度為4％時，可獲得最大酶活156.7U/mL。 (4)30℃，160r/min搖床中恒溫培養(yǎng)72h，黑曲

5、霉生在pH值為5～7的條件下生長較好，其所分泌單寧酶活力較高，pH值為5時，黑曲霉生物量最大，為356.8mg；pH值為6時，單寧酶活力最高，為160.3U/mL。 (5)30℃，160r/min搖床中恒溫培養(yǎng)72h，發(fā)酵液中葡萄糖濃度為0.5～1.0％時，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)單寧酶能力較高，葡萄糖濃度為0.8％黑曲霉產(chǎn)酶能力最高。 (6)30℃，160r/min搖床中恒溫培養(yǎng)72h，接種量為1.5％～2.5％時，黑曲霉所產(chǎn)酶能

6、力較高；接種量為2％時，黑曲霉產(chǎn)酶能力最高。 (7)30℃，160r/min搖床中恒溫培養(yǎng)72h，250mL容量瓶中裝液量為40～60 mL適宜黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生單寧酶，裝液量為50mL時黑曲霉所分泌單寧酶活力最高。 (8)正交試驗得出，各因素及其交互作用對試驗指標影響的主→次順序為：培養(yǎng)時間，培養(yǎng)溫度，發(fā)酵液量，單寧含量，葡萄糖含量，發(fā)酵液初始pH值，接種量；黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)單寧酶最優(yōu)組合為培養(yǎng)時間72h，培養(yǎng)溫度28℃，發(fā)酵

7、液量40mL，澀柿單寧含量3％，葡萄糖含量0.8％，發(fā)酵液初始pH值7.0，接種量2.5％。 (9)動力學(xué)研究表明，以PG為底物時，米氏方程Km=0.595mmol/L，Vm=0.363mol/L·min。 (10)黑曲霉單寧酶催化分解澀柿單寧的適宜pH值范圍為4.0～6.0，最適pH值為5.0；單寧酶在pH值為5～7的體系中活性較為穩(wěn)定。 (11)單寧酶作用的適宜溫度為50～60℃，最適反應(yīng)溫度為55℃；單寧酶