生物防治菌株Agrobacterium vitis E26防治葡萄根癌病相關基因的克隆及功能分析.pdf

1、葡萄根癌病是由葡萄土壤桿菌(Agrobacterium vitis)引起的一種在生產(chǎn)上造成了較大經(jīng)濟損失的世界性病害。本研究組分離到一株無致病性的葡萄土壤桿菌E26菌株(A．vitis E26)，能有效防治葡萄根癌病，具有良好的應用前景。本研究從分子水平研究和分析了E26菌株的生物防治機制。 通過Tn5隨機插入，構(gòu)建菌株E26的突變體文庫，以向日葵為指示植物，最終篩選到兩株生物防治能力下降但對細菌素產(chǎn)生沒有影響的突變體M82和M

2、27。其中M82仍具備誘導煙草上過敏性反應的能力，并且生理生化性狀沒有明顯變化?？寺⊥蛔凅wM82中Tn5插入的基因發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)座子破壞的是一個3.9kb，編碼雜合組氨酸激酶的基因(ahsR)?；パa該基因后，無論在向日葵上還是在葡萄上，都能夠使突變體的生物防治能力得以恢復。以上結(jié)果說明：1)向日葵可以作為指示植物用以篩選E26突變體；2)除細菌素外，還有其他因素影響E26菌株的生物防治機制。3)ahsR編碼的產(chǎn)物很可能是位于信號傳導的上游。

3、 通過構(gòu)建基因組粘粒文庫，在E26中克隆到一套quorum-sensing調(diào)控系統(tǒng)avsI<,E26>-avsR<,E26>。該調(diào)控系統(tǒng)負責合成乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)，并且能夠誘導煙草上的過敏性反應(Hypersensitive response，HR)。Blast分析發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上，AvsI<,E26>和AvsR<,E26>與 A．vitis F2/5中的AvsI<

4、,F2/5>和AvsR <,F2/5>有著最高的同源性，分別是99％和92％。分別缺失avsI<,E26>和 avsR<,E26>后發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)不僅負責調(diào)控AHLs的合成，而且與誘導煙草上過敏性反應以及葡萄上壞死反應能力喪失?；パa這兩個基因后，可以完全恢復其功能。研究還發(fā)現(xiàn)avsI<,E26>和avsR<,E26>與細菌素產(chǎn)生以及其生物防治能力無關。這些結(jié)果在遺傳學證明了口avsI<,E26>-avsR<,E26>調(diào)控系統(tǒng)參與誘導了煙草

5、上的過敏性反應以及葡萄上壞死反應，但與該菌株的產(chǎn)細菌素能力以及其生物防治能力無相關性。構(gòu)建啟動子融和基因發(fā)現(xiàn)，在E. coli DH5a中AvsR<,E26>在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控avsI<,E26>的表達，而且AvsR<,E26>并不嚴格依賴AvsI<,E26>產(chǎn)生的信號。 研究中發(fā)現(xiàn)，E26菌株中的質(zhì)粒有著復雜的遺傳背景。通過接合試驗證明，突變體M82中Tn5插入在一個質(zhì)粒上，該質(zhì)?？梢越雍限D(zhuǎn)移進入報告菌株A．tumefacien

6、ce NTL4(pZLR4)。在野生菌株中轉(zhuǎn)入IncP不相容群的載體，菌株固有的在含X-gal平板上顯藍色的癥狀消失并呈現(xiàn)白色，而且，轉(zhuǎn)入白色菌落檢測不到quorum-sensing信號，而且產(chǎn)細菌素能力也嚴重減弱。當野生菌株轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pDSK519(IncQ)后，會影響到菌株的生物防治能力。這些現(xiàn)象說明E26菌株攜帶的質(zhì)粒可能和源于IncP和IncQ的質(zhì)粒不相容，在質(zhì)粒上有控制產(chǎn)細菌素和調(diào)控quorum-sensing的信號的因子，而且