生物人工腎小管輔助裝置構建方法的初步研究.pdf

1、研究背景：急慢性腎臟功能衰竭是臨床常見的腎臟疾病，二十年來其主要治療方法之一就是以血液透析或血液濾過方式為主的腎臟替代療法。雖然它明顯延緩了腎衰患者的疾病進展，但長期血液透析帶來的一系列的并發(fā)癥以及二十年來居高不下的死亡率仍然無法得到根本解決。研究者認為，目前的腎臟替代療法僅僅替代了腎小球濾過水溶性中小分子物質的功能，而無法提供腎小管的重吸收、代謝、及內分泌等重要生理功能。眾所周知，腎小管細胞在糖原再生、谷胱甘肽合成、以及其他中分子物質

2、重吸收、活化VitD3等方面有著重要作用，從而有助于機體應激狀態(tài)下的防衛(wèi)。但腎臟及其腎小管細胞潛在的免疫學功能，還較少為人認識。同時，人們逐漸認識到，喪失腎功能不再僅僅是疾病嚴重性的標志，而已成為患者死亡率的獨立性預測因素。ARF患者向SIRS和膿毒癥發(fā)展的傾向性也提示腎功能，尤其是發(fā)生ATN后的腎小管細胞的功能在個體應激狀態(tài)下起著關鍵的免疫調節(jié)作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)在敗血癥休克早期就出現(xiàn)腎小管上皮細胞的損害。因此，人們猜測如果及早地替代

3、在膿毒癥休克中受損的腎小管上皮細胞的生理活性，或許可以改善SIRS階段機體的免疫調節(jié)功能，從而減輕進一步破壞性發(fā)展的過程。而目前倍受關注的細胞療法的特點就是利用細胞和組織培養(yǎng)技術擴增某種特定細胞，通過體外循環(huán)或者植入體內的方式，來替代、修復或增強各種疾病狀態(tài)下受損的組織器官的重要生理功能。生物人工腎小管就是基于細胞療法在腎臟病領域應用提出的概念。將一定數(shù)量的腎小管上皮細胞種植在某種稱為生物人工腎小管輔助裝置(Bioartificialr

4、enaltubuleassistdeviceRAD)中，利用裝置內的腎小管上皮細胞活性組成生物反應器，從而人工實現(xiàn)腎小管的生理功能。HumesHD等已經成功完成了生物人工腎小管輔助裝置(BioartificialrenaltubuleassistdeviceRAD)的構建，在體外條件下對裝置進行功能檢測，表明該裝置內腎小管上皮細胞具有轉運功能、代謝功能(活化vitaminD，產生碳酸氫鹽和氨，代謝谷胱甘肽等)、內分泌功能。將RAD串連普

5、通血液濾過器形成生物人工腎(BioartificialKidneyBAK)后，連接至急性腎衰犬模型形成體外血液循環(huán)，證實不但可以實現(xiàn)濾過、轉運、代謝及內分泌等腎臟功能，還可以改善心血管功能不良，調節(jié)系統(tǒng)炎癥失衡，延長動物存活時間。越來越多的人們認識到：大多數(shù)的疾病進程并不是由于缺少某單個蛋白而是通過各種細胞產物間復雜的相互作用的改變而引起的?；诩毎煼ǖ纳锶斯つI小管具有極大的發(fā)展?jié)摿?。正是基于以上基礎理論及應用研究的堅實背景，本著將

6、生物人工腎應用于臨床治療，實現(xiàn)造福各種急慢性腎衰患者的美好愿望，本次研究著重于生物人工腎小管輔助裝置的構建工作，為以后進一步的動物實驗甚至臨床實驗提供工作平臺。 研究目的：初步研究生物人工腎小管的裝置組成，模擬種植細胞的生長條件，從方法學上來探討生物人工腎小管的體外構建過程。 研究方法：一.生物腎小管輔助裝置設計基本構建步驟：用F60高通量血液濾過器和連接管道組成基本裝置待用。取50ml無血清RPMI1640預充濾器內腔

7、。制備層粘連蛋白溶液2μg/m2(無血清RPMI1640)30ml，注入濾器內腔。固定濾器方向，放置1小時后旋轉180°，再放置1小時。0.25％胰酶消化細胞，加入含1％胎牛血清RPMI1640，吹打制備單細胞懸液80mL，細胞計數(shù)約6.2×107。濾器外腔注入10％胎牛血清RPMI1640約150ml。濾器兩端內腔入口各灌入細胞懸液約10ml，固定濾器方向，放置90分鐘。濾器順時針旋轉90°，再次灌注細胞，直到濾器完成旋轉360°后，

8、放入孵箱24小時。以150μl/min的速度向濾過器外腔持續(xù)泵入培養(yǎng)液，持續(xù)4天。以10μl/min的速度向濾過器內腔持續(xù)注入培養(yǎng)液，持續(xù)10天。 二.組織學處理分別在種植細胞第1、4、14天切開濾過器，取出聚砜膜纖維，4％多聚甲醛或95％酒精浸泡固定。常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木紫—伊紅(HE)染色，光鏡下觀察纖維切片。 結果：在種植LLC-PK1細胞第1天取出的聚砜膜纖維切片中，發(fā)現(xiàn)了少量貼壁的細胞，而在種植細胞第4、14