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文檔簡介
1、研究背景:
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease)是以動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)發(fā)展而來的疾病,疾病的進(jìn)展可導(dǎo)致急性冠脈綜合癥(Acutecoronary syndrome)的發(fā)生。斑塊的易損性是受炎癥細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(Matrixmetalloproteinase MMPS)分解斑塊外面的纖維帽引起的。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(Extracellular matr
2、ix metalloproteinase inducer EMMPRIN)它的上調(diào)能增加MMPs的表達(dá)水平,而NF-κB(nuclear factor-kappa B)作為一種轉(zhuǎn)錄因子,它和EMMPRIN在細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中有著密切的聯(lián)系,但它們的關(guān)系目前尚未完全明確。
目的:
研究位于細(xì)胞膜表面的EMMPRIN及核因子κB之間的關(guān)系。探討在急性心肌梗死發(fā)生后,通過酶聯(lián)免疫法檢測患者血清中MMP-9及LTB4的水平及
3、其隨時間的變化情況。
方法:
1細(xì)胞 THP-1細(xì)胞株采用含10%胎牛血清的RPMI-1640于37℃、5% CO2恒溫孵育箱傳代,取對數(shù)生長期,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106cell/L,傳代進(jìn)行試驗(yàn)。THP-1源性巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo):在生長良好的細(xì)胞株中加入PMA(終濃度160 nmol/L),在上述條件下孵育24小時后,懸浮生長的單核細(xì)胞向貼壁生長的巨噬細(xì)胞分化。THP-1源性泡沫細(xì)胞的誘導(dǎo):PMA誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞分
4、化成巨噬細(xì)胞24h后,無血清RPMI-1640洗滌三次,換含LTB4(終濃度為1×10-7)的無血清RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)24h,誘導(dǎo)成泡沫細(xì)胞,油紅O染色對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)進(jìn)行鑒定。
2 Thp-1源性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染濃度梯度摸索取處于對數(shù)生長期的Thp-1源性巨噬細(xì)胞接種于24孔板1-10孔,細(xì)胞呈貼壁生長,調(diào)整細(xì)胞密度至1×1051cell/well,使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的匯合度達(dá)到90%。分別用Opti-MEM稀釋紅色熒光對照(Re
5、d Flourescent Control)和lipofectamine RNAiMAX reagent后(1-10孔中siRNA的濃度從10nmol/L-100nmol/L遞增),按1∶1混合,靜置5分鐘,于1-10孔中每孔加入轉(zhuǎn)染試劑50ul,將細(xì)胞置于37℃、5% CO2恒溫孵育箱孵育24小時,24小時后熒光倒置顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率,選取細(xì)胞內(nèi)熒光最多即轉(zhuǎn)染效率最高的濃度作為轉(zhuǎn)染濃度。
3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)根據(jù)Invitrogen公
6、司網(wǎng)站軟件設(shè)計(jì)合成3對沉默EMMPRIN基因的siRNA干擾序列,siRNA1:正義鏈5'-CACCCACCGCCACAAUAAATT-3',反義鏈5'-UUUAUUGUGGCGGUGGGUGGG-3'。 SiRNA2:正義鏈5'-GGAUUCCGUUCCUUAGGUUTT-3',反義鏈5'-AACCUAAGGAACAGAAUCCTG-3'。并合成對照siRNA:正義鏈5'-AGCGUUCACACCCAACCUGTT-3',反義鏈5'-
7、CAGGUUGGGUGUGAACGCUTT-3'。實(shí)驗(yàn)分為六組:具體見如下實(shí)驗(yàn),分別接種于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。摸索實(shí)驗(yàn)的最佳濃度,24小時后,進(jìn)行轉(zhuǎn)染,siRNA終濃度見如下實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)染后進(jìn)一步誘導(dǎo)成泡沫細(xì)胞形成,37℃培養(yǎng)箱孵育24小時提取蛋白進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
4 NF-κB通道阻滯實(shí)驗(yàn)分四組:對照組、泡沫細(xì)胞組、藥物干預(yù)組1、藥物干預(yù)組2。取處于對數(shù)生長期Thp-1細(xì)胞分別接種于25cm2培養(yǎng)瓶,5ml培養(yǎng)基,PMA誘導(dǎo)成巨噬
8、細(xì)胞24小時后,給藥組加入Bay-117082于37℃、5%CO2、飽和濕度下孵育2小時,再以LTB4孵育24小時誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成。
5 MTS比色法測定NF-κ B阻滯劑Bay-117082不同濃度的細(xì)胞毒性。取對數(shù)生長期、狀態(tài)好的Thp-1源性巨噬細(xì)胞接種于96孔板,每孔100ul培養(yǎng)基,給予不同濃度Bay-117082,每孔加入20ulMTS液,恒溫箱3.5小時,測定各孔吸光值。
6 RT-PCR檢測NF-κ
9、B通道阻滯后細(xì)胞CD147表達(dá)接種于6孔板,按上述方法分組,每組6孔,2ml培養(yǎng)基/孔,PBS洗三遍,利用Trizol提取細(xì)胞總RNA。Real-time PCR檢測細(xì)胞CD147mRNA水平,B-actin為內(nèi)參照。CD147引物序列如下:正義鏈:5'-cctcacagggcaccgctggct-3',反義鏈5'-cggcctccatgttcaggttctcaa-3'。 B-actin引物序列如下:5'-aagatgacccagatc
10、atgtttga-3',反義鏈5'-ttaatgtcacccacgatttcc-3'
7 Western blot檢測轉(zhuǎn)染和NF-κB通道阻滯后細(xì)胞蛋白表達(dá)水平接種于培養(yǎng)瓶上,按上述方法轉(zhuǎn)染及以阻斷NF-κB后,利用蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞收集蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)移槽恒壓半干轉(zhuǎn)30min將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉過夜,P65兔抗一抗室溫孵育2小時(1∶1000PBST稀釋)、CD147兔抗一抗室溫
11、孵育2小時(1∶2000 PBST稀釋)、B-actin兔抗一抗室溫孵育2小時(1∶1000 PBST稀釋),PBST洗膜,辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔二抗于室溫下孵育,PBST洗膜后ECL發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行顯影,檢測曝光強(qiáng)度,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),所有結(jié)果用(x)(□)s表示,兩組間差異顯著性的檢驗(yàn)采用q檢驗(yàn),多組間采用方差分析。
結(jié)果:
1.THP-1細(xì)胞中加入PMA
12、(160nmol/L)誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,然后EMMPRIN-siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞,進(jìn)一步誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成,通過對蛋白的印跡檢測,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中NF-κB的蛋白表達(dá)和對照組相比顯著減少(P<0.05)。
2.THP-1細(xì)胞中加入PMA(160nmol/L)誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,藥物Bay-117082干預(yù)給藥,抑制NF-κ B表達(dá),進(jìn)一步誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成,通過Westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)EMMPRIN的基因
13、和蛋白表達(dá)較對照組相比顯著減少(P<0.05)。
結(jié)論:
本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),LTB4在冠心病的發(fā)展中能促使EMMPRIN表達(dá)的上調(diào)。NF-κ B與冠心病的炎性通路密切相關(guān),而TLB4是否通過EMMPRIN通路上調(diào)NF-κB的表達(dá)我們還尚不可知,在本實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)通過下調(diào)EMMPRIN基因,NF-κ B表達(dá)下降,而抑制NF-κB通道EMMPRIN的表達(dá)也下降,從而說明EMMPRIN與NF-κB存在某些聯(lián)系,而LTB
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