Corin在慢性腎臟疾病和妊娠高血壓中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分慢性腎臟疾病患者尿液及腎臟組織中corin的表達。
　　 目的:
　　 Corin是心臟中發(fā)現(xiàn)的一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，在調(diào)節(jié)血壓和維持心臟功能方面起重要作用。除心臟外，corin也表達于其它組織，如腎臟、骨骼組織、妊娠子宮等。最近有研究發(fā)現(xiàn)腎病模型大鼠腎臟中corin表達顯著降低，提示corin在腎臟功能中起作用。心臟中表達的corin能從細胞表面脫落，可在血漿中檢測到可溶性corin。因此，我們推測腎臟中表

2、達的corin也能脫落，尿液中可能會檢測到corin，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。本研究通過檢測慢性腎臟疾病(chronic kidneydisease，CKD)患者血漿及尿液中的可溶性corin，分析尿液中corin水平與CKD的相關(guān)性;同時還檢測corin蛋白在CKD患者腎臟組織中的表達及分布，進一步探討corin參與CKD病理過程的可能機制。
　　 方法:
　　 1.采集正常人及CKD患者的血液、尿液以及腎臟組織樣本。

3、血液標本以EDTA為抗凝劑，離心后獲取血漿。
　　 2.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測了205例正常人與214例CKD患者血漿及尿液中的可溶性corin。
　　 3.免疫組化（immunohistochemistry，IHC）方法檢測corin蛋白在6例正常人及40例CKD患者腎臟組織中的表達和分布，用Image Pro-Plus軟件分析IHC圖片

4、中陽性染色區(qū)域的平均光密度，評價corin蛋白在正常人及患者腎組織中的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.我們首次在正常人尿液中檢測到可溶性corin，提示腎臟中表達的corin可從細胞表面脫落。男性尿液中corin的水平明顯高于女性(227±107 vs.161±108pg/mL，P=0.00003)，尿液中corin的水平與年齡不相關(guān)。
　　 2.在CKD患者中，男性患者尿液中的corin水平顯著低于正常男性

5、（156±124vs.227±107 pg/mL，P＜0.001）;女性患者尿液中的corin水平也低于正常女性，但統(tǒng)計差異不顯著（144±112 vs.161±108 pg/mL，P=0.181）。
　　 3.多元線性回歸分析結(jié)果提示CKD患者尿液corin水平與腎病類型（慢性腎小球腎炎，P＜0.001;腎病綜合癥，P＜0.001;系統(tǒng)性紅斑狼瘡，P=0.004）和腎小球濾過率(glomerular filtration ra

6、te，GFR)(P＜0.001)密切相關(guān)。舒張壓(diastolicblood pressure，DBP)也是一個相關(guān)因素(P=0.037)。另外，性別也是尿液corin水平的獨立相關(guān)因素(P=0.011)。
　　 4.尿液corin的水平與CKD分級。
　　 按照美國腎臟病協(xié)會對CKD提出的分期方法，按GFR將CKD患者分為1～5級。我們的分析結(jié)果顯示，CKD患者尿液中可溶性corin的水平隨病情的加重而進行性下降，無

7、論男性和女性，5期CKD患者尿液corin水平均為最低。
　　 5.尿液corin的水平與高血壓。
　　 我們的結(jié)果還顯示，伴高血壓患者的尿液corin水平明顯低于正常人或不伴高血壓的CKD患者，從而提示尿液corin的水平與高血壓相關(guān)。
　　 6.Corin蛋白在腎臟組織中的表達。
　　 免疫組化結(jié)果顯示，腎臟中可檢測到corin蛋白，主要位于腎小管上皮細胞中，并且CKD患者腎組織中corin蛋白水平顯

8、著低于正常對照;免疫組化結(jié)果與CKD患者尿液中corin水平低于正常對照的結(jié)果一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.我們首次在正常人尿液中檢測到了corin蛋白，這一結(jié)果提示在腎臟表達的corin能被蛋白酶水解脫落。因此，尿液中corin水平可能反映corin在腎臟中的表達水平。
　　 2.與正常人比較，CKD患者尿液中可溶性corin和腎組織中的corin蛋白表達水平明顯降低。
　　 3.在CKD患者中，尿液

9、中corin水平隨疾病嚴重程度而進行性下降，這一結(jié)果提示，corin可能在慢性腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。我們的結(jié)果提示，尿液中可溶性corin水平可能為CKD的診斷及評估病情提供新的依據(jù)。
　　 第二部分妊娠高血壓患者corin基因突變檢測以及功能研究。
　　 目的:
　　 Corin是心臟中發(fā)現(xiàn)的一種Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，可將心鈉肽前體(pro-atrialnatriuretic peptide，pro-

10、ANP)轉(zhuǎn)化成有活性的ANP，從而調(diào)節(jié)血壓和心臟功能。最新動物模型研究表明corin途徑缺陷可能在妊娠高血壓發(fā)生中起重要作用。本課題中，我們對妊娠高血壓患者的corin基因進行測序，篩查corin基因突變，并且進一步研究corin基因突變對其功能的影響及可能的分子機制，從而幫助了解corin在妊娠高血壓中的病理分子機制。
　　 方法:
　　 1.收集124例正常人和65例妊娠高血壓患者的血液標本，提取基因組DNA，聚合酶

11、鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增corin基因外顯子，測序篩查corin突變基因。
　　 2.以人野生型corin質(zhì)粒為模板，利用定點突變技術(shù)構(gòu)建帶有corin基因突變的表達載體。
　　 3.將野生型corin及突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎(human embryonic kidney，HEK)293細胞，制備細胞裂解液，蛋白質(zhì)免疫印跡法(Westem blot)檢測重組corin蛋白的

12、表達及活化情況。
　　 4.將corin及pro-ANP表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，免疫共沉淀和Westernblot檢測細胞上清中pro-ANP活化為ANP的百分率，評估基因突變對corin功能的影響。
　　 5.將野生型corin及突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞，收集細胞培養(yǎng)上清，免疫共沉淀和Western blot檢測從細胞膜上脫落下來的可溶性corin片段，研究基因突變對corin在細胞表面表達及水解脫落的影

13、響。
　　 結(jié)果:
　　 1.在65例妊娠高血壓患者中發(fā)現(xiàn)一例患者的corin基因1507位腺苷酸(A)改變?yōu)轼B苷酸(G)，導(dǎo)致corin Fz2區(qū)472位絲氨酸(Ser，S)突變?yōu)楦拾彼?Gly，G)，即S472G。我們同時分析了124例正常人的corin基因，未發(fā)現(xiàn)此突變的存在，提示該堿基改變?yōu)榛蛲蛔?，而非基因多態(tài)性。
　　 2.在HEK293細胞表達實驗中，S472G突變不影響corin的表達，但明顯阻礙

14、了corin的活化。功能研究發(fā)現(xiàn)，S472G突變幾乎失去了活化pro-ANP的作用，其活性僅為野生型的～10％。
　　 3.生物化學(xué)和細胞學(xué)研究顯示，S472G影響corin從細胞膜上脫落的過程。在轉(zhuǎn)染野生型corin的細胞培養(yǎng)上清中可檢測到3條可溶性corin條帶(～180，～160，～100 kDa)，而轉(zhuǎn)染S472G的細胞上清中僅檢測到1條～95 kDa的條帶。
　　 結(jié)論:
　　 我們在妊娠高血壓患者中發(fā)

15、現(xiàn)了一個新的corin基因突變S472G，該突變改變corin的蛋白結(jié)構(gòu)，進而影響其功能。細胞生物學(xué)和生化實驗顯示，該突變使corin活化受阻，失去了活化pro-ANP的能力，并且影響了corin從細胞膜上脫落的過程。我們的結(jié)果提示，S472G突變可能參與了妊娠高血壓的發(fā)生和發(fā)展。本研究將有助于了解corin結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，闡述高血壓發(fā)病的新分子機制;同時，corin介導(dǎo)的ANP活化途徑也可能成為妊娠高血壓等疾病診斷和治療的新策略。<