再生家蠶絲素蛋白激發(fā)的T細(xì)胞應(yīng)答.pdf

1、絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白,具有良好的理化特性及生物相容性。再生絲素蛋白是由絲素蛋白經(jīng)物理方式、環(huán)氧劑或SD交聯(lián)而成的新型醫(yī)用生物材料。近年來(lái),研究者通過(guò)物理或化學(xué)方法將絲素蛋白制備了符合臨床實(shí)際需要的再生多孔絲素膜,用于創(chuàng)面的修復(fù)。該材料具有良好的機(jī)械強(qiáng)度,不溶于水,膜的多孔結(jié)構(gòu)使其富有較好通氣性的同時(shí),可阻擋病原微生物侵入創(chuàng)面。該材料經(jīng)機(jī)體吸收后可在體內(nèi)逐漸被降解代謝。本研究在已對(duì)家蠶絲素蛋白對(duì)B細(xì)胞應(yīng)答影響的研究基

2、礎(chǔ)上,又深入探討了不同性狀的再生家蠶絲素蛋白在小動(dòng)物體內(nèi)及體表應(yīng)用后對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的影響,從而為絲素蛋白類(lèi)材料臨床應(yīng)用后的免疫原性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:通過(guò)研究不同性狀再生家蠶絲素蛋白材料對(duì)T細(xì)胞活化、增殖及分化的影響,分析絲素蛋白類(lèi)材料的免疫原性。
　　 方法:
　　 1.液狀再生家蠶絲素蛋白體內(nèi)運(yùn)用對(duì)小鼠T細(xì)胞的激發(fā)作用
　　 將ICR小鼠隨機(jī)分組,每組6只,實(shí)驗(yàn)組經(jīng)腹腔注射1％的液狀再生家蠶

3、絲素蛋白0.5ml／只,以注射等量的無(wú)菌PBS為對(duì)照組。分別于第7d及第14d無(wú)菌取脾臟。制備細(xì)胞懸液作以下分析:
　　 1.1小鼠脾臟細(xì)胞中CD3+CD25+、CD4+CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的分析
　　 將上述分離的脾臟細(xì)胞雹于流式分析管中(3×10+細(xì)胞／管)。分別加入下列抗鼠直標(biāo)抗體:第一組:CD3-FITC、CD25-APC；第二組:CD4-FITC、CD25-APC；第三組:CD4-F

4、ITC、CD25-APC及Foxp3-PE,反應(yīng)后經(jīng)FCM分析。
　　 1.2經(jīng)再生家蠶絲素蛋白處理的小鼠脾臟細(xì)胞對(duì)ConA的反應(yīng)性
　　 將上述分離的小鼠脾臟細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板,2×105／100μL／孔,加入ConA,終濃度分別為0μg／ml、2.5μg／ml及5μg／ml。培養(yǎng)至72h,MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。同時(shí)采用FCM分析CD4+CD25+及CD4+CD25+Foxp3+T的表達(dá)。
　　 2、膜狀

5、再生家蠶絲素蛋白在大鼠創(chuàng)面運(yùn)用后對(duì)T細(xì)胞的激活作用
　　 2.1外科創(chuàng)傷面的建立
　　 將SD大鼠麻醉后經(jīng)外科手術(shù)切除背部皮膚建立創(chuàng)面,面積為2 cm×2 cm。
　　 覆蓋經(jīng)預(yù)處理的膜狀再生多孔絲素,將已切除皮膚的表皮蓋在絲素膜上,進(jìn)行縫合。以PVA海綿設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照,假手術(shù)組為陰性對(duì)照。
　　 2.2移植處皮膚的病理學(xué)變化
　　 分別于術(shù)后第3d、14d、28d、56d及90d,在麻醉狀態(tài)下取移

6、植處皮膚,制作石蠟切片后行HE染色,分析炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及創(chuàng)面愈合情況。
　　 2.3外周血,脾臟及胸腺中T細(xì)胞活化的動(dòng)態(tài)變化
　　 于上述各時(shí)間點(diǎn),取抗凝血分離PBMC,將大鼠處死,分離脾臟及胸腺細(xì)胞經(jīng)FCM檢測(cè)CD3+CD25+T的比率。同時(shí)行免疫組化分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.1液狀再生家蠶絲素蛋白體內(nèi)運(yùn)用后對(duì)小鼠T細(xì)胞活化與分化的影響
　　 FCM分析的結(jié)果顯示,腹腔注射液狀再生絲素蛋白

7、后第7d及第14d,脾臟細(xì)胞中CD3+CD25+T細(xì)胞的百分率分別為(7.32±1.02)％及(7.58±0.98)％；與對(duì)照組((7.262±1.31)％及(6.98±1.22)％)比較稍有升高,但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。CD4+CD25+T細(xì)胞的百分率分別為(7.22±0.92)％及(7.38±0.49)％；與對(duì)照組((7.19±0.55)％及(7.03±0.69)％)比較稍有升高,但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。CD4+CD

8、25+Foxp3+T百分率分別為(3.52±0.62)％及(3.78±0.56)％。與對(duì)照組((3.47±0.31)％及(3.44±0.65)％)比較稍有升高,但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。提示再生絲素蛋白可能對(duì)小鼠T細(xì)胞無(wú)明顯的激發(fā)作用。
　　 1.2.經(jīng)再生家蠶絲素蛋白處理的小鼠脾臟細(xì)胞對(duì)ConA的反應(yīng)性
　　 2、膜狀再生家蠶多孔絲素蛋白對(duì)大鼠T細(xì)胞的激活作用
　　 2.1移植處皮膚的病理學(xué)變化
　

9、　 膜狀再生家蠶絲素蛋白移植后第3d及第14d時(shí),移植處可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞,28d后炎癥細(xì)胞已明顯減少,第56d時(shí)已無(wú)炎癥細(xì)胞。而陽(yáng)性對(duì)照組大鼠術(shù)后均有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),至56d后才逐漸減少。
　　 2.2外周血、脾臟及胸腺細(xì)胞中T細(xì)胞活化的動(dòng)態(tài)變化
　　 于術(shù)后第3d、14d、28d、56d及90d各時(shí)間點(diǎn),膜狀再生家蠶絲素蛋白移植組大鼠PBMC、脾臟及胸腺中CD3+CD25+T細(xì)胞百分比率經(jīng)FCM分析結(jié)果如表4所示:三者