適用于微流系統(tǒng)的順磁微球免疫分析試劑的研究.pdf

1、目的： 目前已有若干國際知名公司的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系列產(chǎn)品及配套儀器進(jìn)入我國，但只有一部分大型醫(yī)院使用。以羅氏公司Elecsys2010型電化學(xué)發(fā)光分析儀為例，儀器體積過大，檢測(cè)時(shí)間長，試劑浪費(fèi)嚴(yán)重，成本升高，而且羅氏電化學(xué)發(fā)光分析儀操作復(fù)雜，維修成本高，因此研制體積小，集成度高，可重復(fù)使用，檢測(cè)成本低的分析儀器已顯的十分重要。 本項(xiàng)目將免疫磁珠技術(shù)與化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，研制適用于微流控芯片分析系統(tǒng)的雙抗夾心法和免疫競(jìng)爭(zhēng)法的

2、試劑，為研制體積小，可重復(fù)使用，檢測(cè)成本低的免疫分析系統(tǒng)創(chuàng)造條件。 方法： 一、聚苯乙烯磁性微球固化抗體 采用碳二亞胺交聯(lián)法，將TSH抗體和羊抗兔IgG抗體固化在聚苯乙烯磁性微球上，制備免疫磁珠，建立穩(wěn)定、高效的免疫磁性微球的固化方法。將微流控芯片、免疫磁珠技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，以順磁微球?yàn)榭贵w的固化載體，通過在芯片系統(tǒng)中構(gòu)建電磁場(chǎng)來富集磁性微球，分離結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物與游離的抗原和抗體，定位免疫反應(yīng)，以達(dá)

3、到微流控芯片重復(fù)使用的目的。 二、基于順磁微球的免疫分析試劑在微流系統(tǒng)中的應(yīng)用 1.選擇魯米諾-過氧化氫發(fā)光系統(tǒng)作為化學(xué)發(fā)光底物，研究溫度、pH值、魯米諾加入濃度、過氧化氫加入濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光的影響，研制化學(xué)發(fā)光底物試劑。 2.分別以TSH和T4為研究對(duì)象，研制適于在微流控芯片系統(tǒng)中使用的雙抗夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法的試劑，并對(duì)試劑的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。 3.收集臨床標(biāo)本，使用建立的實(shí)驗(yàn)方法和自研制的一系列免疫試劑檢測(cè)臨

4、床標(biāo)本，將結(jié)果與羅氏E2010型電化學(xué)發(fā)光分析儀的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1.選擇TSH抗體和羊抗兔IgG抗體的最佳工作濃度均為1:200，交聯(lián)后通過測(cè)定，TSH抗體與聚苯乙烯磁性微球的交聯(lián)率為52.92％，羊抗兔IgG抗體與聚苯乙烯磁性微球的交聯(lián)率為48.6％。 2.經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，固定魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的最適反應(yīng)pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液，最適溫度為室溫，過氧化氫反應(yīng)的最佳加入濃度為0.1mol

5、/L，魯米諾反應(yīng)的最佳加入濃度為5×10-5～mol/L。 3.采用微流控免疫分析芯片系統(tǒng)，用自行交聯(lián)的TSH免疫磁珠和羊抗兔IgG抗體免疫磁珠試劑作為固化抗體的載體，成功對(duì)TSH進(jìn)行了雙抗夾心法免疫分析，對(duì)T4進(jìn)行了免疫競(jìng)爭(zhēng)法免疫分析。分析過程25min內(nèi)完成，試劑加入量?jī)H為10μl。測(cè)定TSH批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV為4.6％，天間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV為4.7％，平均回收率為102.54％，準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)偏移系數(shù)為1.06％；測(cè)定T

6、4批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV為4.9％，天間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV為5.0％，平均回收率為106.26％，準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)偏移系數(shù)為3.19％。收集臨床標(biāo)本，本法與羅氏E2010型電化學(xué)發(fā)光法的檢測(cè)結(jié)果平均符合率TSH為92.67％，T4為96.34％，將TSH和T4的檢測(cè)結(jié)果分別與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，P值均＞0.05，認(rèn)為兩種方法的測(cè)定結(jié)果無顯著性差異，結(jié)果一致，可以進(jìn)行臨床推廣。 結(jié)論： 1.優(yōu)化發(fā)光底物魯米諾