亞慢性過(guò)量氟暴露對(duì)大鼠CRP、C3、C4及Lc影響的研究.pdf

1、本研究旨在通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察亞慢性氟中毒大鼠炎癥細(xì)胞因子CRP、Lc、C3和C4的表達(dá)水平，探討慢性氟中毒過(guò)程中是否伴隨有炎癥反應(yīng)因子水平的改變，進(jìn)而為地氟病的有效治療和尋找敏感、可逆的地氟病防治效果評(píng)價(jià)指標(biāo)提供理論依據(jù)。 材料和方法 一、動(dòng)物分組 選用中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的離乳一周健康Wistar大鼠42只，雌雄各半，體重80±10克，按體重均衡原則隨機(jī)分為3組，每組亦雌雄各半。喂飼全營(yíng)養(yǎng)顆粒大鼠飼料，自由飲

2、用不同濃度的氟化鈉配置的自來(lái)水。實(shí)驗(yàn)周期為3個(gè)月。 具體分組情況如下： 對(duì)照組：飲用自來(lái)水，含F(xiàn)-量為0.31 mg/L； 低劑量組：飲用水中含F(xiàn)量為100mg/L； 高劑量組：飲用水中含F(xiàn)量為200mg/L。 二、主要試劑與儀器 氟化鈉、氯化鈉、檸檬酸三鈉、冰醋酸、氫氧化鈉、鹽酸、水合氯醛、多聚甲醛、無(wú)水乙醇、石蠟、蘇木精、伊紅，Beckman Coulter Immage配套試劑：①稀

3、釋液(硫酸鈉、氯化鈉、二羥甲基脲、鹽酸普魯卡因)、②清洗液(表面活性劑和蛋白酶、不含疊氮化合物)、③溶血?jiǎng)㊣(季銨鹽、異丙醇、氰化鉀)、④散射包(I．溶血?jiǎng)颍簼?rùn)濕劑、甲酸[蟻酸1，Ⅱ．抑制劑：碳酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉)。 氟離子選擇電極、Beckman Coulter Immage血生化分析儀、電子天平、體重稱、．70℃冰箱、光學(xué)顯微鏡。 三、實(shí)驗(yàn)方法 (一)標(biāo)本采集及處理采用大鼠代謝籠收集隔夜尿樣，用于尿氟的測(cè)

4、定。經(jīng)大鼠眼眶內(nèi)眥靜脈叢或腹主靜脈(或右心房)采血，分離血清，用于血氟、血清CRP、Lc、C3和C4的檢測(cè)。采集實(shí)驗(yàn)大鼠的肝臟，用于臟器病理學(xué)檢查。采集大鼠脛骨，用于骨骼病理學(xué)檢查。 (二)肝臟、骨骼組織形態(tài)學(xué)觀察樣品分別為肝臟組織塊和脛骨。 1、石蠟切片的制作過(guò)程 固定：4％多聚甲醛，4℃12h。 脫水：70％、80％、90％的乙醇，依次使用4℃12h；然后采用95％的乙醇，室溫40分鐘；100％的乙醇

5、，室溫20分種，2次。 透明：新鮮二甲苯，室溫6分鐘，2次。 浸蠟、包埋：熔化的石蠟，60℃30分鐘。 切片：切成3-5 μm的薄片。 2、HE染色 脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各置10分鐘，100％乙醇I、Ⅱ各置5分鐘。 水化：95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各置3分鐘，DDW置1分鐘。 蘇木精染色5-10分鐘。 1％鹽酸酒精分化數(shù)秒。 水洗返藍(lán)10-20分鐘。

6、 伊紅染色5-10分鐘。 水洗5-10分鐘。 脫水：75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇各置1分鐘，100％乙醇I、Ⅱ各置2分鐘。 透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各置3分鐘。 封片：滴加中性樹(shù)膠適量，覆蓋蓋玻片。 四、血清CRP、Lc、C3和C4水平測(cè)定 采用免疫比濁法測(cè)定大鼠血清中CRP、C3和C4的水平。采用流式細(xì)胞分析法檢測(cè)大鼠血清中Lc的水平。 檢測(cè)儀器Beckman Coulter

7、Immage工作原理：根據(jù)流體力學(xué)的原理，應(yīng)用VCS三種技術(shù)同時(shí)檢測(cè)(VCS技術(shù)即容量、電導(dǎo)、光散射法來(lái)檢測(cè)血液細(xì)胞的一種新技術(shù))。 五、大鼠氟斑牙分度方法 根據(jù)以下對(duì)氟斑牙的分度方法，每隔2周檢查氟斑牙的發(fā)生情況。具體分度標(biāo)準(zhǔn)如下。 分度(記分) 牙齒表現(xiàn) 正常(0) 釉質(zhì)呈棕黃色半透明、光滑、有光澤。 輕度(1) 釉質(zhì)變白或出現(xiàn)棕白相間條紋，光滑性和光澤度改變不明顯。 中度(2) 釉質(zhì)

8、表面粗糙、無(wú)光澤，可見(jiàn)棕色色素沉著、淺表凹坑狀缺損。 重度(3) 一顆以上切齒明顯磨損、變短，甚至缺失。 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫(kù)，采用單因素方差分析方法和重復(fù)測(cè)量方差分析比較各組間差異。方差不齊時(shí)，采用Welch近似方差法得出F值。滿足方差齊性時(shí)的兩兩比較采用LSD法(Least-significant Difference，最小顯著差值法)，不滿足方差齊性時(shí)的兩兩比較采用Tamban

9、e's T2法。重復(fù)測(cè)量方差分析不滿足球形檢驗(yàn)(Mauchly's test of sphericity)時(shí)采用Greenhouse-Geisser￡校正系數(shù)來(lái)校正自由度。方差分析檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，方差齊性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.1。 七、質(zhì)量控制 (一)實(shí)驗(yàn)大鼠的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的規(guī)范化，以保證實(shí)驗(yàn)的正常開(kāi)展。 (二)檢測(cè)條件的控制，以保證所有儀器和輔助條件在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)準(zhǔn)確可靠，長(zhǎng)期穩(wěn)定可比；試劑在使用期間均放置在冰

10、箱內(nèi)冷藏過(guò)夜。 (三)嚴(yán)格執(zhí)行結(jié)果檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)態(tài)、密切地觀察檢測(cè)過(guò)程各項(xiàng)指標(biāo)的變化，剔除個(gè)體差異過(guò)大的數(shù)值。 (四)標(biāo)本采集操作的規(guī)范化和標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)用盲法，避免主觀因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 (五)正確應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、大鼠氟斑牙的發(fā)生情況 實(shí)驗(yàn)第1個(gè)月末，高劑量組有60％的大鼠出現(xiàn)輕度氟斑牙。實(shí)驗(yàn)第2個(gè)月末，高劑量組有80％的大鼠氟斑牙發(fā)生中度氟斑牙，另有6.7％的

11、大鼠發(fā)生重度氟斑牙；同時(shí)，低劑量組有60％的大鼠發(fā)生中度氟斑牙。至染毒3個(gè)月末時(shí)，100％的染氟組大鼠出現(xiàn)中度氟斑牙，其中高劑量組有20％的大鼠發(fā)生重度氟斑牙。 二、尿氟水平 不同染氟劑量組(低劑量組或高劑量組)大鼠尿氟水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.796，P=0.000)，染氟劑量與測(cè)定時(shí)間之間有交互作用(F=32.490，P=0.000)；不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠的尿氟水平隨染氟劑量的增加而升高，差別

12、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6427.512，P=0.000)。 三、血清氟水平 不同染氟劑量組(低劑量組或高劑量組)大鼠血清氟水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.947，P=0.000)，染氟劑量與測(cè)定時(shí)間之間有交互作用(F=19.351，P=0.000)；不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠的血清氟水平隨染氟劑量的增加而升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1295.079，P=0.000)。 四、血清CRP水平 不同染氟劑

13、量組(低劑量組或高劑量組)大鼠血清CRP水平隨時(shí)間的改變差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.939，P=0.346)，染氟劑量與測(cè)定時(shí)間之間沒(méi)有交互作用(F=0.965，P=0.397)；不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠的血清CRP水平隨染氟劑量的增加而升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.019，P=0.009)。 五、血清補(bǔ)體C3水平 不同染氟劑量組(低劑量組或高劑量組)大鼠血清C3水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.118，P=

14、0.000)，染氟劑量與測(cè)定時(shí)間之間有交互作用(F=3.488，P=0.024)；不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠的血清C3水平隨染氟劑量的增加而降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.067，P=0.000)。 六、血清補(bǔ)體C4水平不同染氟劑量組(低劑量組或高劑量組)大鼠血清C4水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.345，P=0.000)，染氟劑量與測(cè)定時(shí)間之間有交互作用(F=11.891，P=0.000)；不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠的血清C

15、4水平隨染氟劑量的增加而降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=61.688，P=0.000)。 七、血清Lc水平 不同染氟劑量組大鼠血清Lc水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.870，P=0.000)，染氟劑量與測(cè)定時(shí)間之間有交互作用(F=8.856，P=0.000)；不同時(shí)間點(diǎn)，大鼠的血清Lc水平隨染氟劑量的增加而增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.472，P=0.000)。 八、骨組織、肝臟的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)

16、果 隨染氟劑量的增加，大鼠脛骨近端骺板增生明顯活躍，骨小梁數(shù)目增多、增粗，甚至出現(xiàn)硬化型改變；肝細(xì)胞腫脹、變性程度加重，壞死肝細(xì)胞增多。 結(jié)論： 在亞慢性過(guò)量氟暴露的條件下，隨染氟劑量的增加和染氟時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清CRP、Lc水平逐漸升高，但補(bǔ)體C3、C4水平逐漸降低；C4比C3更加敏感。染氟第1個(gè)月末，在染氟組即出現(xiàn)CRP、Lc和C4水平的改變，尤其是在低劑量組，這種改變?cè)缬诜哐赖某霈F(xiàn)。提示炎癥因子CRP