柑橘黃龍病菌亞洲種(Candidatus Liberibacter asiaticus)肽聚糖相關(guān)脂蛋白結(jié)構(gòu)域功能分析.pdf

1、柑橘黃龍病（HLB）是由韌皮部限制性難培養(yǎng)革蘭氏陰性細(xì)菌引起的世界柑橘產(chǎn)業(yè)上的毀滅性病害。肽聚糖相關(guān)脂蛋白(Pal)屬于細(xì)菌外膜蛋白，在許多革蘭氏陰性菌的致病過程中發(fā)揮重要作用。該課題在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)具有效應(yīng)子功能的Pal基因進(jìn)行了深入研究，取得的主要研究成果如下:
　　1.Pal系列基因突變體感染本氏煙草表型分析:本研究采用Gateway技術(shù)分別成功構(gòu)建了Pal跨膜區(qū)基因突變體△Pal6th(aa7-161)、△P

2、al7th(aa8-161)、△Pal8th(aa9-161)、△Pal9th(aa10-161)、△Pal10th(aa11-161)、△Pal11th(aa12-161)、△Pal7th(Phe-Gly)、△Pal8th(Ile-Ala）、△Pal9th(Ile-Ala)和△Pal10th(Leu-Gly)基因的入門載體pDONRTM/Zeo及植物表達(dá)載體pSK103，熱擊轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101后誘導(dǎo)接種至本氏煙草，其中△Pa

3、l6th(aa7-161)-103、△al7th(aa8-161)-103和△Pal7th(Phe-Gly)-103能成功誘導(dǎo)本氏煙草產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)，在6dpi時(shí)局部壞死非常明顯，至12dpi時(shí)煙草組織已經(jīng)完全壞死，而其他缺失突變體和定點(diǎn)突變體基因并未引起本氏煙草的HR反應(yīng)，由此表明第八個(gè)氨基酸異亮氨酸(Ⅱe)為引起本氏煙草HR反應(yīng)的主要氨基酸。
　　2.Pal基因系列突變體在本氏煙草中亞細(xì)胞定位分析:將構(gòu)建成功的Pal跨膜區(qū)

4、基因突變體入門載體△Pal7th(aa8-161)-Zeo、△Pal8th(aa9-161)-Zeo、△Pal7th(Phe-Gly)-Zeo和△Pal8th(Ile-Ala）-Zeo構(gòu)建至植物表達(dá)載體pMW390，經(jīng)農(nóng)桿菌誘導(dǎo)接種至本氏煙草48h后觀察熒光定位信號(hào)，結(jié)果表明:△Pal7th(aa8-161)-390、△Pal8th(aa9-161)-390、△Pal7th(Phe-Gly)-390和△Pal8th(Ile-Ala）-3

5、90在本氏煙草細(xì)胞質(zhì)膜處均存在熒光信號(hào)，同時(shí)，△Pal7th(aa8-161)-390和△Pal7th(Phe-Gly)-390在細(xì)胞核處也存在熒光信號(hào)，△Pal8th(aa9-161)-390和△Pal8th(Ile-Ala）-390未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核熒光定位信號(hào)。
　　3.Pal基因系列突變體引起本氏煙草胼胝體沉積和氧爆發(fā)試驗(yàn)分析:將構(gòu)建成功的Pal基因跨膜區(qū)突變體△Pal7th(aa8-161)-103、△Pal8th(aa9-1

6、61)-103、△Pal7th(Phe-Gly)-103和△Pal8th(Ile-Ala)-103接種至本氏煙草，在熒光顯微鏡下可觀察到△Pal7th(aa8-161)-103和△Pal7th(Phe-Gly)-103在24-48 h能誘導(dǎo)本氏煙上胼胝體的大量積累，同時(shí)采用DAB染色在接種本氏煙草0.5-5 h的時(shí)間段內(nèi)，H2O2的積累也迅速提升，表明Pal基因跨膜區(qū)第八位氨基酸異亮氨酸對(duì)于Pal基因誘導(dǎo)本氏煙草防衛(wèi)反應(yīng)發(fā)生起關(guān)鍵作用。

7、
　　4.Pal基因系列突變體引起紅心柚防衛(wèi)基因表達(dá)分析:將構(gòu)建成功的Pal基因跨膜區(qū)突變體△Pal7th(aa8-161)-103、△Pal8th(aa9-161)-103、△Pal7th(Phe-Gly)-103和△Pal8th(Ile-Ala）-103接種至紅心柚，觀察到△Pal7th(aa8-161)-103和△Pal7th(Phe-Gly)-103基因可引起紅心柚葉片接種口附近產(chǎn)生明顯黃化癥狀，其他突變體及對(duì)照均不存在黃

8、化表型。通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)紅心柚中6個(gè)HR標(biāo)志基因表達(dá)情況表明△Pal7th(Phe-Gly)-103和△Pal8th(Ile-Ala)-103基因均能引起紅心柚防衛(wèi)基因不同程度的表達(dá)變化?！鱌al7th(Phe-Gly)-103基因誘導(dǎo)PR1在8 dpi時(shí)上調(diào)表達(dá)5倍、EDS1在5dpi時(shí)上調(diào)表達(dá)6倍、WRKY1及PAL1在5 dpi時(shí)上調(diào)表達(dá)1.5倍、NPR3在8dpi時(shí)上調(diào)表達(dá)4倍。與△Pal7th(Phe-Gly)-10

9、3基因相比，△Pal8th(Ile-Ala)-103基因在5dpi-8dpi時(shí)誘導(dǎo)HR標(biāo)志性基因PR1、NPR3及EDS1相差了約3倍，可見△Pal7th(Phe-Gly)-103基因啟動(dòng)了紅心柚PTI免疫反應(yīng)。
　　5.Pal基因系列突變體在E.coli中亞細(xì)胞定位分析:利用不依賴于連接反應(yīng)克隆(LIC)技術(shù)成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體△Pal7t(aa8-161)-GFP、△Pal8th(aa9-161)-GFP、△Pal7th(P