柑橘黃龍病菌及與其混合發(fā)生病毒的分子特性及超低溫脫除研究.pdf

1、柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是世界性柑橘生產上的毀滅性病害。易與其混合發(fā)生的幾種柑橘病毒病及類似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎葉病；病原分別為Citrus tristeza virus(CTV)，Citrus exocortis viroid(CEVd)．Citrus tatter leaf virus(CTLV)。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV為對象，從生物學角度及分子水平上對其部

2、分特性進行研究；目的是建立上述4種病原的高靈敏度的分子檢測技術體系；在分子水平上明確其部分分子特性。另外初步探討運用超低溫技術脫除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及機理。主要獲得結果如下： 1．HLB病菌生物學鑒定及PCR檢測體系優(yōu)化。以長春花和椏柑為指示植物，部分 待檢材料表現(xiàn)了明顯HLB癥狀。通過對影響PCR技術的各個主要因素的調整， 建立了HLB病菌PCR、Semi-Nested PCR及Nested-PCR檢測技

3、術；并對三種方 法的檢測靈敏度進行比較，結果發(fā)現(xiàn)Semi-Nested PCR及Nested-PCR檢測靈敏 度遠高于常規(guī)PCR，是常規(guī)PCR的10<'4>倍。運用Nested-PCR技術在黃皮上檢測 出HLB病菌(Candidatus Liberobacter asiaticus)，在國內外屬于首次報道。 2．不同引物檢測HLB病菌靈敏度比較。對基于rplA／rplK，β-operon，16SrDNA和 16S／23S

4、rDNA不同基因組序列設計的5對引物依次為fP400／rP400，fP535／rP535， fA2／rJ5，fOll／rOl2c，fOl2／r23S1檢測HLB病菌靈敏度進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)不 同引物檢測靈敏度不一樣，其檢測靈敏度由高到低依次為：fP400／rP400>fP535／r P535>fA2／rJ5>fOll／rOl2c>fOI2／r23SI。 3．HLB菌亞洲株系分子鑒定。HLB病菌16SrDNA片段RFLP-

5、SSCP分析及基于 16SrDNA序列中國柑橘黃龍病菌屬分類地位的確立，分析結果顯示來自中國7省區(qū)9個代表性的分離物16SrDNA高度保守，全部屬于亞洲菌系(Candidatus Liberobacter asiaticus)。HLB病菌16S／23SrDNA間區(qū)序列分析及系統(tǒng)進化樹分析 結果顯示：來自中國7省區(qū)分布在不同的寄主體內、導致寄主表現(xiàn)不同癥狀的 18個分離物在該區(qū)段沒有發(fā)生顯著變異，各分離物之間的同源性達99％以上，

6、 全部與亞洲菌系(Candidatus Liberobacter asiaticus)高度同源，而與非洲菌系 (Candidatus Liberobacter africanum)差異較大。 4．HLB病菌Somhem blotting檢測。利用α-<'32>p-dCTP標記16SrDNA探針進行HLB 病菌Dot-blotting檢測，結果發(fā)現(xiàn)Dot-blotting檢測靈敏度高于常規(guī)PCR而低于 Semi-Neste

7、d PCR及Nested-PCR，最低檢測下限為30fg總核酸。 5．CTV生物學鑒定、RT-PCR檢測技術的建立及來自不同寄主的21個分離物3'端、 5’端分子特性分析。以墨西哥萊檬和甜橙為指示植物，待檢樣品表現(xiàn)典型的CTV 致病癥狀。核苷酸序列多重比對分析結果顯示：21個CTV分離物的5，端和3' 端共4個變異區(qū)(A區(qū)，F(xiàn)區(qū)，CP，P20)存在明顯的差異。A區(qū)的核苷酸序列相似性最低，為95.92％；F區(qū)的核苷酸序列相似

8、性最高，平均可達98.01％；CP，P20區(qū)的核苷酸序列相似性分別為97.20％，96.39％。21個分離物與GenBank中9個代表性的CTV分離物相應區(qū)段的核苷酸序列平均相似性分別為84.21％，96.12％，96.25％，95.48％，說明CTV分離物之間在A，F(xiàn)，CP，P20 4個區(qū)段核苷酸序列存在較大差異。 　 6．CEVd生物學鑒定及RT-PCR檢測技術建立。以Etrog香櫞為指示植物，待檢樣品表現(xiàn)典型的CEVd致

9、病癥狀。廣東、意大利、重慶中柑所分離物全長cDNA克 隆及序列分析結果發(fā)現(xiàn)：6個CEVd分離物核苷酸序列相互之間具有明顯的差異，同源性介于95.1％-99.2％之間；重慶中柑所分離物ZGS-ZK與意大利分離物Italy-BL核苷酸序列同源性為98.4％，可初步劃歸為相近的株系；廣東分離物XNM-HJ與其它3個分離物核苷酸序列同源性差異在3％左右，因此極有可能為2個不同的株系。 7．CTLV生物學鑒定、RT-PCR檢測及3’端擴

10、增克隆及序列分析。以Rusk枳橙作為指示植物，待檢樣品廣東沙糖桔CTLV-GD表現(xiàn)典型的CTLV致病癥狀。CTLV-GD 3’末端的分子特性分析結果顯示：該分離物3'末端核苷酸序列與日本來自百合的分離物D16681、Li-23(AB004063)同源性高達100％；通過對上述分離物以及GenBank中已發(fā)表序列的ORF2、V-區(qū)以及CP區(qū)進行核苷酸及推導氨基酸序列的同源性比較，進一步證實了我國CTLV-GD分離物與日本分離物高度同源；而

11、且與ASGV也具有一定的同源性，特別是ORF2區(qū)的氨基酸序列同源性高達93.5％。 8．建立了HLB病菌、CTV、CEVd一步法多重RT-PCR檢測體系。敏感性測驗證明該體系能夠同步檢測到10pg總RNA中的HLB和CEVd病原，1pg總RNA中的CTV病毒，說明該體系不失為一種高靈敏度的病原檢測方法。 9．HLB病菌、CTV、CEVd超低溫脫除技術體系初步建立及脫毒機理初探。通過對影響超低溫技術的各個因素的摸索，初步建