褪黑素結(jié)合超低溫療法脫除蘋果莖溝病毒的研究.pdf

1、中國是世界上蘋果生產(chǎn)最大的國家。蘋果病毒病是限制蘋果產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵要素。蘋果莖溝病毒(ASGV)是危害蘋果的重要病毒，在我國蘋果產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生。栽培無毒苗木是目前世界上防治蘋果病毒病的最有效方法，培育無毒苗是栽培無毒苗的關(guān)鍵技術(shù)。而常規(guī)脫毒技術(shù)與超低溫療法難以脫除ASGV。本研究以單感ASGV的蘋果栽培品種‘Gala’試管苗為試驗(yàn)材料，旨在:(1)利用褪黑素結(jié)合超低溫療法脫除蘋果莖溝病毒;(2)建立微樣直接RT-PCR(Microti

2、ssue direct RT-PCR)病毒檢測技術(shù)。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.取1個月苗齡的蘋果試管苗莖段，培養(yǎng)在含有不同濃度褪黑素的基本培養(yǎng)基(BM)中，進(jìn)行遮光處理。分別在處理后1、2和3月后取‘Gala’試管苗莖尖（1.5-2mm帶5-6片葉原基）進(jìn)行小滴玻璃化超低溫療法處理。結(jié)果表明，在超低溫療法處理之后，褪黑素處理的試管苗莖尖的成活率和再生率要高于對照組。其中以15μM的褪黑素處理1個月后獲得的成活率最高，為83％;

3、10μM處理1個月后再生率最高，達(dá)60％。而不加褪黑素的試管苗莖尖的成活和再生率都比較低，分別為70％和37％。
　　2.褪黑素結(jié)合超低溫療法處理獲得的再生植株，用RT-PCR檢測的結(jié)果表明，單一的超低溫療法不能脫除ASGV。褪黑素結(jié)合超低溫處理能夠獲得一定的脫除率，其中，20μM褪黑素處理1月和15μM處理2月結(jié)合超低溫療法的脫毒率為10％，而10μM在處理了1月、2月、3月后都不能獲得脫毒苗。免疫組織化學(xué)法定位ASGV的結(jié)果表

4、明，15μM和20μM的褪黑素處理了1月和2月后，莖尖頂端分生組織的無毒區(qū)明顯擴(kuò)大。
　　3.微樣直接RT-PCR(Microtissue direct RT-PCR)能有效地檢測ASGV。以25G的注射器針頭、苗齡為1個月的取樣效果最佳。實(shí)時熒光定量檢測褪黑素處理2個月的試管苗病毒含量，表明15μM和20μM的褪黑素的確能降低病毒的濃度。
　　本文首次利用褪黑素結(jié)合超低溫療法來脫除蘋果病毒，為脫除蘋果病毒開辟了一條新途徑，