柑橘黃龍病昆蟲(chóng)介體-柑橘木虱的研究及九里香感染黃龍病菌后的差減文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、柑橘黃龍病,也稱作青果病,是柑橘上最嚴(yán)重的病害之一。黃龍病防治至今還沒(méi)有有效的根治方法。柑橘木虱(Diaphorina citri)是黃龍病唯一的傳播媒介。九里香(Murrava paniculata)為蕓香科植物九里香屬植物,是柑橘木虱最喜食的植物之一,感染黃龍病后很少表現(xiàn)癥狀。九里香作為抗黃龍病材料已有研究,但關(guān)于九里香感染黃龍病菌后基因表達(dá)情況研究很少。
　　 本研究采集田間具有典型黃龍病癥狀的樣品,并對(duì)樣品嫁接進(jìn)行室內(nèi)生

2、物學(xué)鑒定、PCR擴(kuò)增確定柑橘黃龍病陽(yáng)性樣品。在室外自然條件下研究柑橘木虱對(duì)福建茶和蕓香科植物的選擇性,觀察柑橘木虱在福建茶和九里香上的生活周期,并在室內(nèi)條件下研究柑橘木虱不同齡期若蟲(chóng)和成蟲(chóng)的饑渴耐受時(shí)間。采用不同濃度海芋乙醇提取物處理柑橘木虱若蟲(chóng)和成蟲(chóng),采用夾毒葉片法分別測(cè)定提取物對(duì)柑橘木虱致死率,研究海芋提取物對(duì)柑橘木虱的生物活性。比較九里香感染黃龍病的不同途徑,找出最佳感染途徑后,收集感染黃龍病的九里香作為研究材料,應(yīng)用SSH方法構(gòu)

3、建了九里香感染黃龍病早期的差減cDNA文庫(kù),分離獲得在黃龍病病程相關(guān)的相關(guān)的cDNA片段,從中篩選出與抗性相關(guān)的基因片段。利用高效熱不對(duì)稱PCR技術(shù)擴(kuò)增感染黃龍病菌的九里香的STH-21的cDNA全長(zhǎng),旨在克隆九里香上與黃龍病相關(guān)蛋白的STH-21蛋白的全長(zhǎng)定量檢測(cè)表達(dá)情況。本文主要研究結(jié)果如下:
　　 柑橘木虱可在福建茶和九里香上生存繁殖,兩者若蟲(chóng)歷期和成蟲(chóng)歷期差異較大,福建茶上若蟲(chóng)期(15.0-20d),成蟲(chóng)期(17-19d

4、),對(duì)照九里香上分別是15.0～17.0d和20.0～23.0d,福建茶上生活周期和九里香上相近,福建茶上為39.0-44.0d,九里香為39.0-45.0d九里香上若蟲(chóng)發(fā)育為成蟲(chóng)成活率為16.9％。比九里香低。福建茶對(duì)柑橘木虱是一種可接受寄主而不是最適合的寄主.柑橘木虱對(duì)寄主選擇性測(cè)定顯示該蟲(chóng)在選擇各寄主之間差異明顯,最適寄主為黃皮和九里香,其次是檸檬,沙田柚、紅江橙和椏柑差異不大,很少取食枳殼。耐饑渴能力測(cè)試結(jié)果表明,低齡若蟲(chóng)和高齡

5、若蟲(chóng)在供水缺食物時(shí)平均存活時(shí)間分別為10.0～12.0h和39.0～40.0 h,成蟲(chóng)可存活69.0～75.0h；在缺水供食物的條件下,平均存活時(shí)間分別為8.0～8.8h和35.0～37.0h,成蟲(chóng)為48.0～50.0h,在缺水缺食物的情況下,平均存活為7.7～8.2 h和15.0～18.0左右,成蟲(chóng)為36.0～38.0h。水分能延長(zhǎng)柑橘木虱存活時(shí)間,成蟲(chóng)的耐受能力強(qiáng)于若蟲(chóng)。海芋揮發(fā)性物質(zhì)和不同濃度乙醇提取物毒殺效果表明:揮發(fā)性氣體物質(zhì)

6、0.5h內(nèi)對(duì)柑橘木虱有強(qiáng)效毒殺作用。各級(jí)濃度提取物乙醇溶液對(duì)柑橘木虱成蟲(chóng)和若蟲(chóng)均有不同程度的殺滅效果。10克/100mL對(duì)木虱才有很強(qiáng)的毒殺作用,3h時(shí)每組死亡的平均數(shù)量為9.3,7h后幾乎全部死亡,校正死亡率分別為45.6％和98.4％。提取物濃度為5克/100mL時(shí),3H和24h后每組的平均校正死亡率分別為23.5％和71.0％。隨著濃度的降低到0.1克/100mL,平均校正死亡率分別為8.5％和11.5％基本失去了毒殺作用。

7、>　　 采用汁液摩擦、注射和擠壓法,接種2個(gè)月后不能在九里香植株體內(nèi)檢測(cè)到黃龍病菌；黃龍病陽(yáng)性接穗紅江橙(Citrus sinensis Osbeck)嫁接九里香能使黃龍病菌成功侵染九里香,但接穗不能抽芽。草地菟絲子(Cuscuta campestris)和蟲(chóng)媒柑橘木虱(Diaphorina citri)都能成功從陽(yáng)性植株體內(nèi)將黃龍病菌傳播至九里香。柑橘木虱傳“毒”效率結(jié)果顯示:木虱在紅江橙陽(yáng)性植株上取食1.5h-2h就能攜帶黃龍病菌

8、,病原從柑橘木虱傳到健康的九里香上最短需要12h,單頭木虱帶菌就能使九里香成功感染黃龍病菌。溫度對(duì)病原的傳播效率有較大影響,氣溫高于35℃或低于15℃時(shí),介體昆蟲(chóng)活力差,傳播病原的效率較低,0℃溫度下木虱幾乎不傳播病原。40℃時(shí)昆蟲(chóng)死亡率高,活力差。
　　 采用抑制差減雜交技術(shù),構(gòu)建了柑橘黃龍病菌侵染九里香后不同時(shí)段的混合樣品SSH正向和反向文庫(kù)。Nest-PCR結(jié)果表明,插入片段大小平均為400 bp大小從0.2 kb到1kb

9、不等。通過(guò)反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)兩個(gè)差減文庫(kù)中400個(gè)片段進(jìn)行篩選(正向300個(gè),反向100個(gè)),共獲得了167個(gè)差異EST表達(dá)片段。其中黃龍病菌誘導(dǎo)寄主上調(diào)表達(dá)的基因115個(gè),下調(diào)表達(dá)的基因52個(gè)。利用BLASTn和BLASTx對(duì)所得EST進(jìn)行相似性分析,結(jié)果顯示,目前在柑橘中報(bào)道的僅有10個(gè),其它絕大部分來(lái)源于擬南芥、蓖麻屬、和番茄等。在167個(gè)ESTs片段中,36％尚不能推斷明確其功能,其余64％涉及抗病防御、轉(zhuǎn)錄、信

10、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量、代謝、蛋白質(zhì)合成等信號(hào)途徑,提示黃龍病菌與寄主互作是一個(gè)多基因參與的過(guò)程。研究結(jié)果對(duì)認(rèn)識(shí)黃龍病菌.寄主互作的分子機(jī)制和尋找抗病相關(guān)基因有理論與實(shí)踐意義。
　　 半定量PCR用來(lái)檢測(cè)文庫(kù)中miraculin-like protein,sthp2-21,ubiquitin-conjugating enzyme8,chlorophyll A/B binding protein片段感染黃龍病菌前期表達(dá)情況,結(jié)果顯示,mir

11、aculin-Iike protein,sthp2-21,ubiquitin-conjugating enzyme8屬于上調(diào)表達(dá)基因,chlorophyll A/B binding protein屬于下調(diào)表達(dá)基因,獲得了九里香病程相關(guān)蛋白STH21基因的cDNA全長(zhǎng)序列。該基因與葡萄屬(fragaria)的同源性為68％,與馬鈴薯pSTH-21基因核酸序列的同源性為67％,與其它植物的同源性為50％～60％。半定量RT-PCR分析表明,