水稻稻瘟病抗性基因Pita2與白葉枯病抗性基因Xa31(t)物理圖譜的構(gòu)建及候選基因驗證.pdf

1、水稻是世界上的主要糧食作物之一，水稻稻瘟病和白葉枯病是目前最嚴重的2種水稻病害。利用水稻宿主的抗性基因進行水稻抗性品種的培育來預(yù)防水稻病害是最經(jīng)濟和環(huán)保的方式。但稻瘟病和白葉枯病病菌的群體變異頻繁，導(dǎo)致水稻抗性基因的抗病效果減弱甚至喪失。因此，需要對水稻抗病基因進行廣泛挖掘和深入研究以應(yīng)對水稻抗性育種的需求。前期研究表明水稻稻瘟病廣譜抗病基因 Pita2和水稻白葉枯病廣譜抗性基因Xa31(t)都位于水稻染色體較復(fù)雜的區(qū)域，其目標區(qū)段與水

2、稻日本晴及9311的基因組比對都存在較大差異，不能通過常規(guī)的電子定位和LD-PCR等技術(shù)進行分離和克隆。因而我們構(gòu)建了 Pita2供體品種 PiNo.4以及 Xa31(t)供體品種 ZCL的Fosmid文庫，并對其進行篩選、測序，對所得序列進行基因的預(yù)測，候選基因的遺傳轉(zhuǎn)化及功能驗證。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過優(yōu)化和改進實驗條件，建立了一種水稻種子基因組 DNA快速高效的提取方法。該方法在兩小時內(nèi)可以提取384個樣品，PCR

3、擴增目的片段可以達到1.2 kb。應(yīng)用該提取方法，成功準確高效的完成了對課題組自主培育的雜交稻駿優(yōu)522的純度鑒定。該方法簡單廉價高通量，可以滿足分子標記輔助育種、圖位克隆、聚合育種、種子純度鑒定等應(yīng)用要求，在隨后抗性基因的研究中也得到了充分利用。⑵PiNo.4和ZCL的Fosmid文庫的平均插入片段為35 kb，其滴度分別為2.7×105 Cfu/lib與7.7×105 Cfu/lib，基因組覆蓋度均為8.2-11.7倍，隨機單克隆末

4、端測序顯示基本都為水稻基因組序列，菌體連續(xù)培養(yǎng)5代之后其重組質(zhì)粒依然穩(wěn)定存在，以上結(jié)果表明：所構(gòu)建的2個文庫均可以用于后期的文庫篩選。⑶在Pita2研究方面，通過對本課題組前期篩選出的分子標記的進一步驗證，挑選出8對特異性分子標記，進行 PiNo.4文庫的篩選，獲得覆蓋Pita2候選區(qū)域的3個Fosmid克隆，并構(gòu)建了Pita2區(qū)域基于抗性親本PiNo.4的物理圖譜。從10個預(yù)測基因中挑選5個候選基因進行克隆及遺傳轉(zhuǎn)化。到目前為止5個候

5、選基因已經(jīng)全部進行了遺傳轉(zhuǎn)化，其中3個候選基因（Pita2-seq4、Pita2-seq6、Pita2-seq9）的T0代轉(zhuǎn)基因植株已經(jīng)進行了陽性鑒定；其余2個候選基因（Pita2-seq5、Pita2-seq8）正在進行轉(zhuǎn)基因植株的移栽。⑷在Xa31(t)研究方面，通過對本課題組前期篩選出的分子標記的進一步驗證，挑選出4對特異性分子標記進行 ZCL文庫的篩選，將覆蓋Xa31(t)候選區(qū)域的1個克隆進行測序，并進行基因的預(yù)測及功能分析。