GABA能抑制對(duì)小鼠下丘神經(jīng)元時(shí)間反應(yīng)特性的影響.pdf

1、感覺(jué)信息在中樞的編碼方式一直是感覺(jué)系統(tǒng)研究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)。聽覺(jué)系統(tǒng)是重要的感覺(jué)系統(tǒng)之一，被認(rèn)為是研究中樞對(duì)外在信息處理機(jī)制的理想模型。聲音信息的編碼機(jī)制在對(duì)聽覺(jué)功能和機(jī)制的研究中占重要地位，但頻率和聲強(qiáng)作為聲音的兩個(gè)基本參數(shù)，其編碼機(jī)制尚不明確。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)（率）編碼了聲音參數(shù)。近十幾年來(lái)，動(dòng)作電位的產(chǎn)生時(shí)間，尤其是第一動(dòng)作電位潛伏期（first spike latency，F(xiàn)SL），由于其可能攜帶的大量感覺(jué)信息，引起了

2、越來(lái)越多的關(guān)注。在聽覺(jué)系統(tǒng)研究中，F(xiàn)SL通常定義為從聲音刺激的開始到第一個(gè)動(dòng)作電位發(fā)放出現(xiàn)之間的時(shí)間間隔。本實(shí)驗(yàn)室前期研究確定了FSL表征聲刺激強(qiáng)度和頻率遠(yuǎn)較動(dòng)作電位數(shù)（率）更為穩(wěn)定、準(zhǔn)確，并表現(xiàn)出高度的同一性。因此有必要對(duì)FSL的產(chǎn)生機(jī)制、影響因素進(jìn)行深入研究。 哺乳動(dòng)物中腦下丘作為聽覺(jué)系統(tǒng)的重要中繼核團(tuán)，在時(shí)空信息編碼及時(shí)空整合中扮演重要角色。下丘神經(jīng)元接受興奮性和抑制性輸入。其抑制性輸入主要為γ-氨基丁酸（Gamma-am

3、inobutyric acid，GABA）能和甘氨酸（glycine，Gly）能。離子微電泳GABA和Gly拮抗劑荷包牡丹堿、馬錢子堿可改變下丘神經(jīng)元的聲反應(yīng)特征。此類研究多集中在蝙蝠上，主要以動(dòng)作電位數(shù)為觀察指標(biāo)，而對(duì)FSL影響的報(bào)道很少。下丘不僅接受聽覺(jué)通路上行傳導(dǎo)纖維也接受離皮層的下行傳導(dǎo)纖維。下行傳導(dǎo)纖維來(lái)自聽覺(jué)離皮層系統(tǒng)，即起自聽皮層直接和間接投射到皮層下聽覺(jué)核團(tuán)甚至耳蝸的下行纖維。離皮層系統(tǒng)可改變下丘神經(jīng)元的聲音反應(yīng)特性，如

4、閾值、最佳響應(yīng)頻率等。但離皮層系統(tǒng)是否影響下丘神經(jīng)元FSL和時(shí)間反應(yīng)特性尚未見相關(guān)報(bào)導(dǎo)。 本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，神經(jīng)元FSL主要由傳遞延時(shí)和效能延時(shí)兩部分組成。傳遞延時(shí)也稱最小延時(shí)，不因刺激強(qiáng)度改變而變化，包括聲刺激傳遞到內(nèi)耳毛細(xì)胞聲傳延時(shí)、沿軸突傳遞的動(dòng)作電位傳遞延時(shí)，以及經(jīng)突觸的固有傳遞時(shí)間。而效能延時(shí)是因刺激強(qiáng)度而改變的延時(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用BALB/c小鼠，用在體細(xì)胞外方法記錄下丘聽覺(jué)神經(jīng)元對(duì)聲音刺激的時(shí)間反應(yīng)特性，并比較下

5、丘微電泳荷包牡丹堿（BMI）和聽皮層給予BMI后下丘神經(jīng)元時(shí)間反應(yīng)特性改變，以期解決以下三個(gè)主要問(wèn)題：1、GABA抑制作用是否參與了下丘神經(jīng)元FSL形成，GABA作用的環(huán)節(jié)在哪里；2、FSL的變化對(duì)信息表征的意義；3、聽覺(jué)下行傳導(dǎo)通路是否影響下丘神經(jīng)元FSL。 細(xì)胞外記錄在隔音防回聲的屏蔽室內(nèi)完成。先將置于自制的塑料泡沫模子中的BALB/c小鼠懸掛在防震臺(tái)的支架上，接著以固定在顱頂平面長(zhǎng)約1.5 cm的平頭金屬釘固定動(dòng)物頭部。而

6、后在下丘部位頭骨鉆孔，剝離硬腦膜，暴露下丘表面。被用于研究下行通路作用的小鼠同時(shí)暴露同側(cè)聽皮層。分別以多管和單管微電極進(jìn)行在體細(xì)胞外記錄，記錄并分析局部微電泳BMI和聽皮層給予BMI后下丘神經(jīng)元對(duì)聲刺激產(chǎn)生的FSL改變。 聲刺激由位于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頭部正前方30cm處的揚(yáng)聲器發(fā)出，為自由場(chǎng)給聲方式。所有聲音信息都是由三個(gè)基本參量構(gòu)成，即聲刺激的頻率、強(qiáng)度和時(shí)長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用相當(dāng)于只刺激某一基底膜部位的純頻聲刺激，即單一頻率聲音，其幅度由

7、包絡(luò)波控制。包絡(luò)波分為上升部分（起始部分，onset）、穩(wěn)態(tài)部分（steady-state）和下降部分（結(jié)束部分，offset）。實(shí)驗(yàn)室通常經(jīng)以下參數(shù)控制聲刺激包絡(luò)波：上升時(shí)間（rise time，RT）、上升函數(shù)（rise function，RF）和下降時(shí)間（fall time，F(xiàn)T）及下降函數(shù)（fall function，F(xiàn)F）和穩(wěn)態(tài)聲強(qiáng)（即最大聲強(qiáng)，steady-state pressure，SP）。將聲音包絡(luò)波參數(shù)設(shè)定為時(shí)程50

8、 ms，上升和下降時(shí)間分別為20和5 ms，上升函數(shù)為余弦平方函數(shù)。以上聲音參數(shù)通過(guò)Tucker-DavisTechnologies系統(tǒng)3來(lái)編輯，通過(guò)計(jì)算機(jī)用BrainWare軟件控制和改變刺激強(qiáng)度和頻率。 聲刺激誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位。信噪比大于4：1的電信號(hào)視為動(dòng)作電位，具有相同波形特性的動(dòng)作電位確定為單單位。單單位動(dòng)作電位被認(rèn)為來(lái)自于單個(gè)神經(jīng)元。確定單個(gè)神經(jīng)元反應(yīng)后，通過(guò)改變短純音刺激的頻率和強(qiáng)度（頻率-強(qiáng)度掃描），記錄神

9、經(jīng)元對(duì)聲刺激的頻響特性。以動(dòng)作電位數(shù)（率）為指標(biāo)，確定該神經(jīng)元的特征頻率（characteristic frequency，CF）和最小閾值（minimum threshold，MT）。最小閾值是神經(jīng)元對(duì)30%相同聲刺激產(chǎn)生反應(yīng)的最小聲刺激強(qiáng)度，特征頻率是神經(jīng)元對(duì)最小聲刺激強(qiáng)度產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)的聲刺激頻率。然后，在下丘神經(jīng)元局部微電泳GABAA受體拮抗劑BMI和昕皮層給予BMI，再重復(fù)頻率-強(qiáng)度掃描。記錄數(shù)據(jù)后，離線計(jì)算神經(jīng)元對(duì)相同聲刺激產(chǎn)生

10、動(dòng)作電位的平均FSL。分別以動(dòng)作電位數(shù)和FSL為指標(biāo)，分析局部微電泳BMI和聽皮層給予BMI對(duì)下丘神經(jīng)元聲反應(yīng)特性的影響，從而確定GABA抑制作用和聽覺(jué)下行傳導(dǎo)通路對(duì)下丘神經(jīng)元FSL的影響及其影響成份，并進(jìn)一步闡明FSL變化的生物學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)共記錄到88個(gè)下丘神經(jīng)元反應(yīng)。神經(jīng)元特征頻率分布在7.5～38 kHz，最低閾值范圍10～80 dB SPL，最低閾值與特征頻率之間沒(méi)有特定關(guān)聯(lián)。下丘神經(jīng)元的頻率調(diào)諧曲線主要為V型，其次為

11、U型，另有少量的多峰型和寬帶型。在淺麻醉狀態(tài)下，下丘神經(jīng)元自發(fā)放電很少，神經(jīng)元的動(dòng)作電位發(fā)放模式分為相位型（phase）、相位緊張型（phasic-tonic）、準(zhǔn)緊張型（quasi-tonic）和緊張型（tonic）四類。以動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)為指標(biāo)，神經(jīng)元對(duì)某一純音反應(yīng)的發(fā)放數(shù)-強(qiáng)度曲線分為非單調(diào)型（non-monotonic）、單調(diào)型（monotonic）、飽和型（saturate）_種類型，且同一神經(jīng)元對(duì)不同頻率聲刺激可呈現(xiàn)不同的反應(yīng)

12、類型；神經(jīng)元對(duì)某一強(qiáng)度下不同頻率聲刺激的發(fā)放數(shù)-頻率反應(yīng)曲線雖總體呈現(xiàn)倒V型，但變異性較大。而以FSL為指標(biāo)時(shí)，神經(jīng)元對(duì)不同頻率反應(yīng)的FSL-強(qiáng)度曲線只表現(xiàn)為潛伏期隨聲強(qiáng)衰減而單調(diào)延長(zhǎng)的特性；神經(jīng)元對(duì)不同強(qiáng)度下的FSL-頻率反應(yīng)曲線呈V型或W型，神經(jīng)元的最小潛伏期總是對(duì)應(yīng)于特征頻率。這種反應(yīng)特性表明潛伏期對(duì)聲刺激強(qiáng)度和頻率表征更穩(wěn)定和準(zhǔn)確。神經(jīng)元對(duì)不同頻率反應(yīng)的FSL-強(qiáng)度曲線，可由心理物理學(xué)上Pieron法則來(lái)描述：y=Ai×e（-x

13、/ti）+y0i，其中y為神經(jīng)元對(duì)聲刺激反應(yīng)的FSL，x是用dB SPL表示的刺激聲音幅度，y0，A，t為三個(gè)擬合常數(shù)。y0是當(dāng)X軸聲強(qiáng)接近無(wú)限時(shí)曲線上的延時(shí)，即最小延時(shí)（MFSL），i代表不同的頻率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聲刺激的頻率不同，y0，A值不同，而t卻不受刺激頻率的影響；不過(guò)不同神經(jīng)元其t值不同。 88個(gè)下丘神經(jīng)元中有38個(gè)進(jìn)行了局部微電泳BMI實(shí)驗(yàn)。微電泳BMI后，97.4%（37/38）的神經(jīng)元發(fā)放數(shù)增高，動(dòng)作電位發(fā)放類

14、型多由相位型轉(zhuǎn)變?yōu)橄辔痪o張型和緊張型。大多神經(jīng)元（30/38）特征頻率不改變，有8個(gè)神經(jīng)元的特征頻率發(fā)生漂移，偏移幅度在±0.5～3 kHz間。特征頻率偏移與神經(jīng)特征頻率間沒(méi)有關(guān)聯(lián)。22個(gè)（57.9%）神經(jīng)元最小閾值下降，12個(gè)（31.6%）神經(jīng)元最小閾值不變，4個(gè)（10.5%）神經(jīng)元出現(xiàn)最小閾值上升；微電泳BMI所致的最小閾值變化與神經(jīng)元最小閾值呈一定線性關(guān)系（y=-0.3138x+5.8495 R2=0.3492）。最小閾值?。?2

15、0 dB SPL）的神經(jīng)元，其最小閾值增高，最小閾值大（>20 dB SPL）的神經(jīng)元，微電泳BMI降低其最小閾值，而且最小閾值越大其變化幅度也大；通常神經(jīng)元對(duì)非特征頻率反應(yīng)的閾值改變較特性頻率的大。38個(gè)下丘神經(jīng)元最小潛伏期范圍在9.62～34.13（15.39±5.62）ms。微電泳BMI使27個(gè)神經(jīng)元FSL縮短、8個(gè)神經(jīng)元FSL延長(zhǎng)，3個(gè)神經(jīng)元FSL不變。給藥后FSL-強(qiáng)度曲線經(jīng)水平或/和垂直移動(dòng)可與給藥前FSL-強(qiáng)度曲線重合，表

16、明微電泳BMI并不改變神經(jīng)元的FSL-強(qiáng)度反應(yīng)特性，即曲線斜率。垂直移位代表MSFL改變，水平移位代表神經(jīng)元最小閾值變化。特征頻率改變的8個(gè)神經(jīng)元中，6個(gè)神經(jīng)元曲線垂直移位，即MFSL改變；而特征頻率未變的30神經(jīng)元中，有25個(gè)曲線只呈水平移位，即微電泳BMI只改變了神經(jīng)元閾值?；谏鲜鼋Y(jié)果，本文得出結(jié)論，GABA參與小鼠下丘神經(jīng)元FSL形成，從FSL-聲強(qiáng)曲線變化關(guān)系可以推斷阻斷GABAA受體可以改變最小閾值和MFSL，即信息傳遞與整

17、合的突觸效能和突觸群。由于MSFL改變往往伴隨神經(jīng)元特征頻率的變化，因此本研究結(jié)果還提示，深入研究MFSL與特征頻率的變化關(guān)系，不僅可完善聽覺(jué)中樞的時(shí)間編碼原理，還可能闡明聽覺(jué)中樞時(shí)間編碼聲刺激頻率特性的機(jī)制。 下丘神經(jīng)元接受離皮層系統(tǒng)的廣泛調(diào)節(jié)作用。給予小鼠聽皮層荷包牡丹堿，觀察了皮層神經(jīng)元GABAA受體阻斷下對(duì)下丘神經(jīng)元反應(yīng)潛伏期的影響。88個(gè)神經(jīng)元中有25個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行了離皮層作用研究。在皮層荷包牡丹堿作用后，下丘神經(jīng)元?jiǎng)幼?/p>

18、電位發(fā)放數(shù)減少或不變；神經(jīng)元的最小閾值變化則以上升和保持不變?yōu)橹?，分別占神經(jīng)元總數(shù)的52%（13/25）和44%（11/25）；FSL延長(zhǎng)的神經(jīng)元有16個(gè)（64%），F(xiàn)SL縮短的神經(jīng)元有3個(gè)（12%），F(xiàn)SL不變的神經(jīng)元有6個(gè)（24%）。FSL對(duì)聲強(qiáng)的表達(dá)關(guān)系仍為FSL隨聲強(qiáng)衰減而單調(diào)延長(zhǎng)，F(xiàn)SL與頻率關(guān)系仍為特征頻率下FSL最短，偏離特征頻率越遠(yuǎn)FSL越長(zhǎng)。因此，可以推斷皮層神經(jīng)元GABAA受體阻斷后對(duì)下丘神經(jīng)元主要起抑制作用，但不改