茶樹(shù)脫水素基因的克隆與非生物脅迫下蛋白的Western-blot分析.pdf

1、茶樹(shù)是一種多年生的木本植物，在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中受到多種逆境因素的影響。為了提高茶樹(shù)的抗逆性，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的茶樹(shù)品種，一般都采用優(yōu)化栽培措施，改善栽培條件等，但是品種的抗逆遺傳特性才是起決定作用的因素。研究茶樹(shù)抗逆機(jī)理，發(fā)掘抗性相關(guān)基因及蛋白，對(duì)開(kāi)展茶樹(shù)分子育種有著積極意義。本研究采用基因克?。≧ACE）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-blot）技術(shù)，研究了不同脅迫下茶樹(shù)葉片中脫水素基因及蛋白家族的表達(dá)模式，得出以下結(jié)論：
　　1

2、、從茶樹(shù)中克隆得到 CsDHN3的cDNA全長(zhǎng)序列，序列分析表明其全長(zhǎng)為869 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為627 bp，編碼208個(gè)氨基酸，為21.7 kD小分子量的中性多肽，其預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)為6.95。序列分析表明為親水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白，進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)茶樹(shù) CsDHN3與油茶的親緣關(guān)系最近。運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)分析了茶樹(shù)不同組織（頂芽、成熟葉片、花、根和種子）中 CsDHN3的表達(dá)水平，結(jié)果表明，CsDHN3具有組織

3、特異性且主要分布在茶樹(shù)種子中。隨著脫水處理時(shí)間的增加而增加，到30 h的時(shí)候表達(dá)量達(dá)到最大值為對(duì)照的2.13倍，此時(shí)種子中的含水量已經(jīng)降到20.04％，之后CsDHN3的表達(dá)量出現(xiàn)明顯的下調(diào)。
　　2、茶樹(shù)葉片總蛋白提取通過(guò)TCA-丙酮沉淀法、試劑盒法和酚-甲醇/醋酸銨沉淀法比較發(fā)現(xiàn)，其中酚-甲醇/醋酸銨沉淀法用時(shí)短，蛋白濃度高、SDS-PAGE電泳條帶清晰，背景干凈，滿足Western-blot技術(shù)要求。
　　3、在非生物

4、脅迫（低溫、干旱、ABA、BR）處理下，對(duì)10種不同分子量的茶樹(shù)脫水素蛋白的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其中95、65和48 kD3種蛋白表達(dá)量較為穩(wěn)定。58 kD僅在干旱處理25 d達(dá)到最大值，復(fù)水后又趨于對(duì)照水平；37 kD僅在AB A處理12 h時(shí)達(dá)到最大值，之后又逐漸降低。34 kD在低溫和干旱處理下均上升；在ABA處理12 h時(shí)達(dá)到最大值，之后又逐漸降低。28 kD在低溫處理下表達(dá)量逐漸上升；在BR處理下逐漸的降低。26 kD僅在