擬南芥醇腈酶基因(AtHNL)啟動(dòng)子的克隆及其應(yīng)答非生物脅迫和激素反應(yīng)的初步分析.pdf

1、醇腈酶(hydroxynitrile lyase，HNL; Oxynitrilase，E.C.4.1.2.x)，作為一種生物催化劑，能可逆地催化氰化氫(HCN)和醛或酮類化合物反應(yīng)生成手性氰醇化合物或手性藥物。根據(jù)其催化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型，HNL分為R型和S型。目前，兩種類型HNL在工業(yè)上均得到了廣泛的應(yīng)用。在自然界中，HNL主要作為有機(jī)體的一種裂解酶用于分解醇腈而產(chǎn)生HCN，該過程稱為生氰作用。植物體內(nèi)由于HNL對(duì)氰醇的生物催化反應(yīng)釋放出

2、HCN，主要用于抵御食草動(dòng)物、真菌的侵襲和機(jī)械破壞。此外，氰醇作為生氰的糖苷主要用來儲(chǔ)存氫氰酸，同時(shí)參與氮源的轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝。盡管目前已報(bào)道的產(chǎn)氰植物超過有4000種。作為HNL催化反應(yīng)的副產(chǎn)物，HCN被認(rèn)為最多的是與抑制線粒體修復(fù)途徑中的末端細(xì)胞色素氧化酶活性有關(guān)。不過越來越多的數(shù)據(jù)表明，HCN可能在植物的許多生理過程中起到調(diào)節(jié)作用（包括種子萌發(fā)、硝酸鹽吸收及響應(yīng)外界環(huán)境刺激等）。
　　最近，通過序列比對(duì)及分析，擬南芥中報(bào)道了一

3、個(gè)具有α/β水解酶活性的R型HNL(AtHNL)，且具有較高的催化活性扣對(duì)映體選擇性而具有較高的工業(yè)應(yīng)用前景。上述結(jié)果暗示傳統(tǒng)的非生氰植物中可能存在酶促產(chǎn)生HCN的途徑。此外，基因芯片結(jié)果表明，AtHNL基因顯著的受冷害、NaC1及干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，不過AtHNL是否存在誘導(dǎo)調(diào)節(jié)機(jī)制，其上游啟動(dòng)子序列中是否存在受逆境脅迫調(diào)控的元件需要進(jìn)一步的闡述。此外，AtHNL基因是否在非生物脅迫中起到調(diào)控作用也需要深入研究。因此，本研究通過克隆和

4、分析AtHNL啟動(dòng)子序列，通過轉(zhuǎn)基因擬南芥，及結(jié)合非生物脅迫和激素處理下啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控模式研究，為加深和理解AtHNL基因的調(diào)節(jié)機(jī)制，并對(duì)AtHNL在植物響應(yīng)外界環(huán)境刺激中可能起到的作用提供一定的理論研究意義。此外，本研究還對(duì)AtHNL啟動(dòng)子中可能存在新的順式作用元件進(jìn)行發(fā)掘。
　　在本研究中，為了研究AtHNL啟動(dòng)子的表達(dá)特征，首先克隆了長(zhǎng)約2.1kb的AtHNL啟動(dòng)子序列（pHNL，-2023至+67），以及pHNL的一系列

5、相關(guān)5'缺失的片段（5D1，-933到+67;5D2，-733到+67;5D3，-533到+67;5D4，-333到+67;5D5，-133到+67）;通過構(gòu)建表達(dá)載體，將所有克隆到的啟動(dòng)子片段融合到GUS（β-glucuronidase）基因的上游后，用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥獲得的轉(zhuǎn)基因植株，用于分析外界刺激（尤其是干旱、高鹽和冷脅迫）及激素處理對(duì)AtHNL啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的影響。結(jié)果表明:pHNL能夠響應(yīng)鹽脅迫，凍害及茉莉酸甲酯(MeJA)

6、的誘導(dǎo)。這可能與啟動(dòng)子序列中含有的環(huán)境脅迫誘導(dǎo)及茉莉酸響應(yīng)元件有關(guān);此外，AtHNL啟動(dòng)子還明顯受干旱、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)不同程度的負(fù)調(diào)控表達(dá)，這可能與啟動(dòng)子中的CGTCA-motif，TATC-box，GARE-motif, TCA-element等關(guān)鍵作用元件的分布有關(guān)。此外，序列截短實(shí)驗(yàn)表明:5D1、5D2、5D4和5D5轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性較pHNL高;而5D3片段轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS活性基本檢測(cè)不