小麥CBL基因和CIPK基因的克隆及在非生物脅迫中的功能研究.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物,其種植面積、總產(chǎn)量及總貿(mào)易額均居糧食作物之首。干旱、高鹽等是嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的非生物逆境,研究小麥對(duì)逆境信號(hào)的感知、傳導(dǎo)以及抗逆性的分子機(jī)制,對(duì)小麥抗逆分子育種研究與開(kāi)發(fā)具有重要意義。Ca2+作為第二信使介導(dǎo)植物對(duì)各種不同逆境脅迫的反應(yīng),這其中涉及到復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。類鈣調(diào)磷酸酶B蛋白(CalcineurinB-Like,CBL)和其互作蛋白激酶(CBL-interactingproteinkina

2、se,CIPK)是與非生物逆境脅迫相關(guān)的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中很重要的組分。然而到目前為止,除了發(fā)現(xiàn)一個(gè)小麥CIPK基因(WPK4)參與細(xì)胞分裂素以及光和營(yíng)養(yǎng)脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)外,對(duì)小麥CBL和CIPK基因的系統(tǒng)研究還未見(jiàn)報(bào)道。我們?cè)趯?duì)DFCI數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中小麥CBL和CIPK基因相關(guān)EST序列的搜索和分析的基礎(chǔ)上,利用RACE技術(shù)分別成功地克隆了7個(gè)CBL基因和8個(gè)CIPK基因,并對(duì)它們編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。利用酵母雙雜交方法

3、研究了CBL和CIPK之間特異的相互作用。利用RT-PCR和qRT-PCR技術(shù)分析了這些基因在不同非生物脅迫逆境處理下的表達(dá)水平。另外,進(jìn)一步通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)TaCIPK14基因和轉(zhuǎn)TaCIPK29基因的煙草在非生物脅迫下的表型,生理生化指標(biāo)與分子機(jī)制的分析,揭示了TaCIPK14和TaCIPK29在非生物脅迫中功能和作用機(jī)理,取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1)小麥CBL和CIPK蛋白與水稻同源的CBL和CIPK蛋白的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)高度

4、相似,這些CBL蛋白均含有四個(gè)能結(jié)合Ca2+的EF-hands結(jié)構(gòu)域和一個(gè)FPSF結(jié)構(gòu)域;CIPK蛋白都含有激酶結(jié)構(gòu)域,FISL結(jié)構(gòu)域和PPI結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析顯示,小麥CBL蛋白和CIPK蛋白和水稻同源CBL蛋白和CIPK蛋白都?xì)w類于相同的亞族。
　　2)基因表達(dá)分析結(jié)果表明,小麥特定的CBL或CIPK基因?qū)?、鹽、滲透脅迫和ABA處理的響應(yīng)模式不同,而且同一處理能夠被不同的CBL或CIPK基因感應(yīng),這說(shuō)明小麥CBL和CIPK基因

5、可能介導(dǎo)對(duì)不同脅迫信號(hào)的交聯(lián)過(guò)程。
　　3)利用酵母雙雜交技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),小麥不同的CBL和CIPK蛋白之間的相互作用的特異性和強(qiáng)度不同。一些重要的特異性的CBL-CIPK互作子如:TaCBL1-TaCIPK9,TaCBL1-TaCIPK23,TaCBL2-TaCIPK2,TaCBL3-TaCIPK2,TaCBL2-TaCIPK29和TaCBL3-TaCIPK29可能參與小麥對(duì)不同非生物脅迫的響應(yīng)。這些結(jié)果表明,小麥CBL和CIPK

6、對(duì)不同非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過(guò)形成不同的CBL-CIPK復(fù)合物來(lái)解碼特定脅迫下產(chǎn)生的特異Ca2+信號(hào)。
　　4)系統(tǒng)分析了TaCIPK14基因和TaCIPK29基因在非生物脅迫反應(yīng)中的作用。TaCIPK14基因受冷、滲透脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫以及脅迫相關(guān)信號(hào)分子ABA、乙烯和H2O2誘導(dǎo)。證明了在煙草中過(guò)表達(dá)TaCIPK14基因可提高轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)冷和鹽脅迫的抗性。TaCIPK14提高對(duì)冷和鹽的抗性是通過(guò)調(diào)控一些抗氧化酶或脅

7、迫相關(guān)基因如NtCAT,NtDREB3和NtLEA等的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。增強(qiáng)的抗氧化酶的活性有助于清除逆境下產(chǎn)生的過(guò)量ROS,減輕ROS對(duì)細(xì)胞膜的損傷。同時(shí),TaCIPK14能降低轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下的Na+含量和提高細(xì)胞的K+/Na+比率,這也有助于植物對(duì)鹽脅迫的抗性。
　　5)TaCIPK29基因能夠被鹽、冷、甲基紫晶(MV)、ABA和乙烯誘導(dǎo)。過(guò)表達(dá)TaCIPK29基因的煙草植株增強(qiáng)了對(duì)鹽脅迫的抗性。TaCIPK29通過(guò)提高一些

8、通道蛋白基因如NtSOS1,NtNHX2,NtNHX4和NtCAX3的表達(dá)來(lái)維持高的K+/Na+比和Ca2+含量以及通過(guò)增強(qiáng)CAT和POD的表達(dá)和活性來(lái)減少H2O2對(duì)細(xì)胞膜的損傷來(lái)抵抗鹽脅迫的傷害。TaCIPK29沒(méi)有特定的定位信號(hào),在整個(gè)細(xì)胞中都有分布。TaCIPK29不僅能夠特異地與小麥的TaCBL2和TaCBL3互作,也能與煙草的NtCBL2和NtCBL3互作,說(shuō)明TaCIPK29通過(guò)CBL2和CBL3傳遞Ca2+信號(hào)。同時(shí)TaC

9、IPK29還能與煙草的NtCAT1相互作用,增強(qiáng)其活性,這有助于清除過(guò)多的H2O2。因此,TaCIPK29是一個(gè)鹽脅迫中的正調(diào)控因子,參與了鹽脅迫下對(duì)離子和ROS的調(diào)控。
　　綜上所述,如同水稻和擬南芥中同源的CBL和CIPK基因一樣,小麥CBL和CIPK基因也是非生物脅迫響應(yīng)基因。不同的CBL和CIPK基因可能賦予植物對(duì)不同逆境的抗性。已鑒定的抗逆基因TaCIPK14和TaCIPK29可作為培育轉(zhuǎn)基因抗逆小麥新品種的候選基因。本