番茄SlNAC4和SlDEAD31基因在果實(shí)成熟及非生物脅迫響應(yīng)中的功能研究.pdf

1、NAC((N)AM/(A)TAF1/2/(C)UC2)轉(zhuǎn)錄因子家族基因和DEAD-box解旋酶家族基因在植物生長發(fā)育，生物和非生物脅迫響應(yīng)中均發(fā)揮重要功能。其中，NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特異的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，目前有關(guān) NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能研究已取得很大進(jìn)展，但主要集中于模式植物擬南芥和水稻中。另外，盡管部分成員的功能被研究確定，但 NAC轉(zhuǎn)錄因子在分子水平上發(fā)揮功能的機(jī)制依然尚未清楚地闡明。番茄不僅是世界上廣為栽培的高營養(yǎng)高價(jià)值的蔬

2、菜作物，同時(shí)也是研究肉質(zhì)果實(shí)發(fā)育和成熟的最佳模式植物。當(dāng)前有關(guān)番茄中發(fā)育或脅迫相關(guān)的NAC基因的報(bào)道依然很少。番茄nor(non-ripening)突變體的形成正是因?yàn)镹AC家族中N OR基因的突變引起的，這激發(fā)我們繼續(xù)挖掘N AC基因家族中其他可能參與果實(shí)成熟調(diào)控的新成員。最近，番茄全基因組測序的完成為研究番茄中特定基因的功能提供了信息基礎(chǔ)和方便。在本研究中，我們?cè)谇芽茢?shù)據(jù)庫 SGN中篩選到7個(gè)番茄NAC基因，分別命名為SlNAC4-

3、SlNAC10。隨后，我對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、分子特征、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及對(duì)多種激素和非生物脅迫的響應(yīng)等進(jìn)行了系統(tǒng)分析。我們發(fā)現(xiàn)它們編碼的氨基酸序列與已知的其他植物NAC蛋白具有很高的相似性，特別是在NAC結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)分析表明，除了SlNAC10基因外，其他六個(gè)SlNAC基因均包含保守的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。進(jìn)化樹分析表明，SlNAC4屬于脅迫相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子，而SlNAC5、SlNAC7和SlNAC10屬于發(fā)育有關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子。定量RT-P

4、CR分析表明，這七個(gè)SlNAC基因均表現(xiàn)出不同的組織特異性表達(dá)特征（比如根、葉、花和果實(shí)），說明它們可能在番茄生長發(fā)育過程中發(fā)揮著特異的和重要的作用。除了SlNAC6基因，其他六個(gè)SlNAC基因的表達(dá)受到多種激素處理的不同程度誘導(dǎo)，包括ABA、ACC、GA3、MeJA和IAA。同時(shí)，SlNAC4-SlNAC10基因的表達(dá)也受到多種非生物脅迫處理的不同程度誘導(dǎo)，包括鹽、高溫、低溫，脫水和傷害。這些結(jié)果為進(jìn)一步探索 NAC基因在番茄生長發(fā)育

5、以及環(huán)境逆境脅迫響應(yīng)中的功能提供了有價(jià)值的信息。
　　根據(jù)基因組織表達(dá)模式的結(jié)果，我們篩選出了SlNAC4基因，其在果實(shí)成熟時(shí)期高量表達(dá)而在青果中少量表達(dá)，暗示 SlNAC4基因可能參與了果實(shí)的成熟調(diào)控過程。果實(shí)成熟是一個(gè)高度程序化的復(fù)雜生物學(xué)過程，涉及眾多因素的參與，包括內(nèi)源激素和遺傳調(diào)控因子以及外部環(huán)境信號(hào)等。目前雖已證實(shí)NOR基因是位于乙烯信號(hào)途徑的上游位點(diǎn)發(fā)揮作用，但其發(fā)揮功能的的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。為了進(jìn)一步探索 SlNA

6、C4基因在果實(shí)成熟中的功能，我們通過 RNAi技術(shù)抑制了SlNAC4基因在番茄中的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因果實(shí)表現(xiàn)出抑制的果實(shí)成熟表型、葉綠素降解受阻、果實(shí)成熟時(shí)間延遲、乙烯合成量減少（主要是因?yàn)橐蚁┖铣上嚓P(guān)基因的表達(dá)被下調(diào)）以及類胡蘿卜素積累降低（主要是因?yàn)轭惡}卜素合成途徑受影響）。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中多個(gè)成熟相關(guān)基因的表達(dá)也表現(xiàn)出顯著的下調(diào)。這些結(jié)果表明SlNAC4蛋白是作為正調(diào)控因子，通過影響乙烯的合成和類胡蘿卜素的積累從而參與調(diào)控番茄果

7、實(shí)的成熟過程。此外，我們發(fā)現(xiàn) SlNAC4基因的表達(dá)不受乙烯的誘導(dǎo)，且在成熟調(diào)控因子RIN的上游位點(diǎn)正調(diào)控其表達(dá)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)還表明，SlNAC4蛋白可分別與NOR及RIN蛋白相互作用。這些結(jié)果表明，SlNAC4蛋白能通過依賴于乙烯和不依賴于乙烯的信號(hào)途徑在果實(shí)成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中影響果實(shí)的成熟過程。
　　另外，考慮到 SlNAC4基因的表達(dá)受鹽和脫水脅迫的顯著誘導(dǎo)，且SlNAC4-RNAi轉(zhuǎn)基因果實(shí)中乙烯合成量減少，而乙烯已被證實(shí)在

8、植物脅迫響應(yīng)中也扮演著重要角色，暗示 SlNAC4基因可能在非脅迫響應(yīng)中也具有一定的功能。為了驗(yàn)證這一功能，我們比較了鹽和干旱脅迫對(duì)WT和SlNAC4-RNAi轉(zhuǎn)基因植株生長的影響。結(jié)果表明，在發(fā)芽后幼苗生長階段，轉(zhuǎn)基因植株根和芽的生長受鹽脅迫的抑制比WT番茄植株更為明顯。葉子的鹽水侵泡實(shí)驗(yàn)表明，與W T相比，轉(zhuǎn)基因植株含有更低的葉綠素含量，說明SlNAC4-RNAi轉(zhuǎn)基因植株的鹽耐受性較差。此外，SlNAC4-RNAi轉(zhuǎn)基因植株在土壤

9、中的鹽和干旱脅迫耐受性也變差，主要表現(xiàn)為脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株含有更低水平的葉綠素和相對(duì)含水量，且葉片的失水速率更快。我們還發(fā)現(xiàn)，在正常和鹽脅迫情況下，SlNAC4-RNAi轉(zhuǎn)基因植株中多個(gè)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平均出現(xiàn)下調(diào)。這些結(jié)果表明SlNAC4蛋白是作為正調(diào)控因子在非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其在今后改良番茄鹽和干旱脅迫耐受性中具有一定的應(yīng)用價(jià)值?？傊?，SlNAC4基因不僅可通過調(diào)控乙烯的生物合成和類胡蘿卜素積累來參與調(diào)控番茄果實(shí)的

10、成熟過程，同時(shí) SlNAC4基因在番茄非生物脅迫響應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。
　　目前，DEAD-box解旋酶被證實(shí)參與花、種子以及根等的發(fā)育，而其在植物脅迫響應(yīng)方面的功能研究還處于起步階段。盡管大量的DEAD-box RNA解旋酶基因在植物中已被鑒定，但是有關(guān)植物中DEAD-box RNA解旋酶參與脅迫響應(yīng)的相關(guān)報(bào)道依然有限，且多集中在模式植物擬南芥中，而它們發(fā)揮功能的具體機(jī)制也依然不清楚。目前，有關(guān)番茄中DEAD-box RNA解旋

11、酶基因的具體功能研究依然未見報(bào)道。本研究中，經(jīng)過篩選，我們鑒定了兩個(gè)番茄DEAD-box RNA解旋酶基因，隨后它們分別被命名為 SlDEAD30和SlDEAD31。組織表達(dá)模式分析表明，SlDEAD30基因在根和成熟葉中的表達(dá)相對(duì)較高，而在其他組織中的表達(dá)較弱。SlDEAD31基因則在番茄所有檢測的組織中幾乎恒量表達(dá)。進(jìn)化樹分析表明SlDEAD30和SlDEAD31均屬于脅迫相關(guān)的DEAD-box RNA解旋酶蛋白。另外，番茄SlDE

12、AD30和SlDEAD31基因的表達(dá)受多種非生物脅迫的誘導(dǎo)，包括NaCl、脫水、高溫和低溫等。SlDEAD30基因的表達(dá)未受所處理激素的明顯誘導(dǎo)，而SlDEAD31基因的表達(dá)則受 MeJA的誘導(dǎo)。此外，我們通過超表達(dá)和沉默以進(jìn)一步研究SlDEAD31基因的功能。我們發(fā)現(xiàn)，SlDEAD31基因的沉默可能是致死的，而SlDEAD31基因的超表達(dá)并不能明顯影響番茄果實(shí)的正常發(fā)育與成熟。隨后，我們繼續(xù)探索其在番茄鹽和干旱脅迫中的可能功能。結(jié)果表

13、明，SlDEAD31超表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄植株在發(fā)芽后幼苗生長階段中表現(xiàn)出增強(qiáng)的鹽耐受性。此外，超表達(dá)植株在土壤中也表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的鹽脅迫耐受性，但對(duì)干旱脅迫耐受性的增強(qiáng)不是很明顯，主要表現(xiàn)為：與WT植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中多個(gè)生物和非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，以及更高的存活率、相對(duì)含水量和葉綠素含量，更低的丙二醛含量和水分損失速率。這些結(jié)果表明我們初步在番茄中鑒定了SlDEAD30和SlDEAD31基因，并證實(shí)SlDEAD31蛋白作為正

14、調(diào)控因子在番茄非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，為今后通過調(diào)控“DNA/RNA解旋”的方式提高植物抵御環(huán)境脅迫的能力奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究從番茄中分別篩選出七個(gè) NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因和兩個(gè)DEAD-bo x RN A解旋酶基因，并對(duì)SlNAC4和SlDEAD31基因在番茄果實(shí)成熟和非生物脅迫響應(yīng)中的功能和機(jī)制進(jìn)行了初步探索和分析，對(duì)全面闡明 SlNAC4和SlDEAD31基因在植物中的功能和機(jī)理以及日后它們可能在基因工程