柑橘果實(shí)成熟特異基因CsPEMI-InvI轉(zhuǎn)化番茄的研究.pdf

1、柑橘是我國(guó)第二大果樹，浙江省是我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)。面對(duì)激烈的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)，提高柑橘果實(shí)品質(zhì)，培育優(yōu)良品種成為發(fā)展柑橘產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵。目前，關(guān)于柑橘果實(shí)品質(zhì)形成的研究主要集中在糖酸代謝、色澤、貯藏保鮮、以及類胡蘿卜素代謝等方面，對(duì)于果實(shí)成熟相關(guān)基因的研究報(bào)道并不多。研究果實(shí)成熟相關(guān)基因的表達(dá)及調(diào)控，對(duì)揭示果實(shí)成熟的分子機(jī)制及利用生物技術(shù)來(lái)提高果實(shí)品質(zhì)均有十分重要的意義。前期研究獲得了一個(gè)柑橘果實(shí)成熟特異表達(dá)基因CsPEMI-InvI，并構(gòu)建了含有該目

2、的基因的雙元表達(dá)載體。
　　 本研究以矮化番茄品種Micro-Tom為試材，試優(yōu)化番茄抗卡那霉素的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了轉(zhuǎn)化柑橘果實(shí)成熟特異表達(dá)基因CsPEMI-InvI的抗性植株，利用PCR以及qRT-PCR技術(shù)對(duì)抗性植株進(jìn)行分子鑒定，最終確定CsPEMI-InvI基因已經(jīng)整合到Micro-Tom番茄基因組中，并在番茄植株中穩(wěn)定表達(dá);以Micro-Tom番茄野生植株為對(duì)照，利用生物化學(xué)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株葉片中果膠甲酯酶和轉(zhuǎn)化酶的

3、活性，初步確定了柑橘果實(shí)成熟特異基因CsPEMI-InvI的功能。主要研究結(jié)果概括如下：⑴通過(guò)篩選Kan和Cef的濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌浸染濃度及時(shí)間，試優(yōu)化Micro-Tom番茄抗卡那霉素的遺傳轉(zhuǎn)化體系。根據(jù)優(yōu)化的體系用柑橘果實(shí)成熟特異基因CsPEMI-InvI轉(zhuǎn)化Micro-Tom番茄。切取苗齡10d左右的Micro-Tom番茄子葉和下胚軸為外植體，農(nóng)桿菌菌液濃度OD600=0.5～1.0之間，MS稀釋菌液OD600=0.1，將外

4、植體放在OD600=0.1的農(nóng)桿菌菌液中浸染20 min，接種到不含抗生素的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2 d;共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移至Kan濃度為100 mg.L-1，Cef濃度為400 mg.L-1的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，最終得到17株轉(zhuǎn)基因植株。⑵以Micro-Tom番茄野生植株為對(duì)照，利用PCR及qRT-PCR技術(shù)對(duì)抗性植株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明CsPMEI-InvI基因已成功整合到Micro-Tom番茄基因組中，并在番茄葉片中穩(wěn)定表達(dá)。⑶以Micro