檸檬苦素合成關(guān)鍵基因citLGT轉(zhuǎn)化柑橘的研究.pdf

1、我國是世界最大的柑橘生產(chǎn)國，栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位。近年來我國除了穩(wěn)步提升柑橘罐頭的生產(chǎn)和出口外，也在不斷推進橙汁加工業(yè)的發(fā)展進程。目前在橙汁加工中仍存在一些難題需要克服，其中榨汁后出現(xiàn)的“延遲苦味”(delayed bitterness)問題是限制臍橙等橙汁加工業(yè)發(fā)展的一個重要因素。延遲苦味現(xiàn)象是由酶催化的檸堿等苦味物質(zhì)的生物合成引起的。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬苦酸A-環(huán)內(nèi)酯(limonoate A-ring lactone，LARL)是檸

2、堿合成的直接前體，它在果實正常成熟過程中逐漸被檸檬苦素UDP-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(1imonoidUDP-glycosyltransferases，LGTase)糖基化為配糖體(LG)，而在果實受到機械損傷等外界環(huán)境脅迫時就會轉(zhuǎn)化為具有強烈苦味的檸堿。因而，可以通過改變LARL在果實中的積累從而影響LARL向檸堿的轉(zhuǎn)化，進一步影響后苦味形成。本實驗從溫州蜜柑中克隆了檸檬苦素UDP-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因citLGT，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化調(diào)控

3、其在轉(zhuǎn)基因錦橙中的異位表達，為探討該基因影響后苦味性狀的分子機制和基因工程改良柑桔延遲苦味性狀提供了新的思路和材料。取得的階段性結(jié)果有以下幾方面:
　　1.檸檬苦素類似物糖基轉(zhuǎn)移酶基因citLGT編碼序列及RNAi功能序列的克隆
　　根據(jù)前人的研究報道，設(shè)計特異引物，從溫州蜜柑基因組中擴增獲得citLGT基因編碼序列;參考RNA干擾原理及RNAi載體構(gòu)建策略，設(shè)計三對特異引物分別從citLGT基因不同位置擴增獲得三段長分別為

4、268bp、176bp和302bp特異性序列作為RNA干擾目的片段。
　　2.組成型啟動子(CaMV35S)控制的citLGT基因的超量表達和RNAi抑制表達載體的構(gòu)建
　　將citLGT基因克隆到載體pMD19-T上，三段RNAi干擾序列分別克隆到PGEM-T載體上，然后分別構(gòu)建了citLGT基因的植物超量表達載體p35S:citLGT和三個RNAi抑制表達載體p35S:eitLGT-RNAi-1、p35S:citLGT-

5、RNAi-2、p35S:citLGT-RNAi-3。另外，還構(gòu)建了只含有RNAi抑制表達載體正、反義片段間隔序列查耳酮合成酶基因（CHSA）內(nèi)含子（intron）的對照載體p35S:intron。
　　3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相關(guān)植物表達載體對柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定
　　將構(gòu)建的citLGT基因的相關(guān)植物表達載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化有延遲苦味的錦橙，經(jīng)GUS染色和PCR檢測篩選共獲得了40株轉(zhuǎn)基因植株。
　　4.

6、轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因的整合分析
　　從獲得的不同載體轉(zhuǎn)基因株系中分別選取三株，大量提取葉片基因組DNA，分別對提取的DNA中的GUS基因進行southern印記雜交分析外源基因在轉(zhuǎn)基因植株基因組中的整合情況。結(jié)果表明，外源基因已經(jīng)成功整合到轉(zhuǎn)基因錦橙基因組中。
　　5.轉(zhuǎn)基因植株中citLGT基因的表達分析
　　從得到的轉(zhuǎn)基因植株分別提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后以actin基因為內(nèi)參、野生型錦橙植株為對照進行q