花生維生素E合成關(guān)鍵酶基因(VTE3、HPT)的克隆、序列分析與γ-tmt基因的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，對(duì)動(dòng)、植物和人體都有非常重要的生理作用。然而天然維生素E只能由光合細(xì)菌和綠色植物合成，人體必須從外界攝取。植物油是人體攝取維生素E的主要途徑?；ㄉ鳛橹匾挠土献魑?，是人體所需維生素E的重要來(lái)源之一。本研究基于花生EST序列，結(jié)合RT-PCR技術(shù)以及以基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增方法，首次從花生中克隆了維生素E合成途徑的關(guān)鍵酶基因2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因（VTE3）和尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶

2、基因（HPT），并且分別克隆了13個(gè)不同類型花生栽培品種和6個(gè)二倍體野生種的VTE3 DNA序列，在比較各序列同源性的基礎(chǔ)上，對(duì)不同類型花生栽培品種是否有相同起源問(wèn)題以及花生栽培種與各野生種之間的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析探討；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將擬南芥γ-維生素E甲基轉(zhuǎn)移酶基因（γ-tmt）轉(zhuǎn)入花生栽培品種得到T0代和T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）從豐花2號(hào)、蘭娜1號(hào)和荔浦大花生3個(gè)栽培品種中分別克隆到2條V

3、TE3 cDNA片段，命名為rVTE3-1和rVTE3-2。品種間相應(yīng)序列同源性為100％。rVTE3-1和rVTE3-2的編碼區(qū)長(zhǎng)1059 bp，均編碼351個(gè)氨基酸，二者核苷酸序列同源性97.8％，存在10個(gè)變異位點(diǎn)，其中8個(gè)為SNP變異；氨基酸序列同源性98.6％，存在5個(gè)氨基酸差異。
　　 （2）從花生栽培品種Krapt.st.16中克隆得到一條HPT cDNA片段，長(zhǎng)1269 bp，命名為AhHPT。AhHPT最大開(kāi)放

4、閱讀框?yàn)?230 bp，編碼含有409個(gè)氨基酸殘基，與大豆、苜蓿、木薯、擬南芥等16種植物的HPT蛋白序列同源性較高，為61.46％ ～79.71％。
　　 （3）從13個(gè)栽培品種分別克隆得到2條VTE3 DNA片段，命名為gVTE3-1和gVTE3-2。gVTE3-1在13個(gè)品種間核苷酸序列同源性為99.9％，gVTE3-2核苷酸序列同源性為100％。豐花2號(hào)gVTE3-1和gVTE3-2同源性96.6％，內(nèi)含子存在36個(gè)SN

5、P位點(diǎn)和3個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別的多態(tài)性位點(diǎn)。從6個(gè)二倍體野生花生分別克隆得到一條VTE3 DNA片段，A染色體組4個(gè)野生種以及B染色體組野生種A.Batizocoi的gVTE3同源性達(dá)99.9％以上，僅有2個(gè)堿基的差異。B染色體組野生種A.Ipaensis的gVTE3與其余野生種gVTE3同源性相對(duì)較低，為97.0％。A.Ipaensis的gVTE3與豐花2號(hào)gVTE3-2同源性100％；豐花2號(hào)gVTE3-1與A染色體組野生種的gVTE

6、3同源性相對(duì)較高，最高為98.7％。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，豐花2號(hào)的gVTE3-2與A.Ipaensis的gVTE3聚為一組；A染色體組4個(gè)野生種和B染色體組野生種A.Batizocoi的gVTE3以及豐花2號(hào)gVTE3-1聚為一組。
　　 （4）得到164株具有PPT抗性并且PCR檢測(cè)目的基因（γ-tmt）呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)擴(kuò)繁后移栽成活T0代單株560個(gè)，獲得其T1代種子；獲得來(lái)自34個(gè)株系T1代單株356個(gè)，經(jīng)PCR檢測(cè)其中