太子參皂苷合成關鍵酶HMGR基因的克隆與轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、太子參系石竹科草本植物異葉假繁縷的塊根，在臨床上用于多種經(jīng)典補益配方，亦是多種中成藥的重要成分之一，有抗疲勞、抗應激、增強免疫力等藥理作用，是福建省最具特色的大宗道地藥材之一。皂苷（Saponin）是皂苷或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，其主要功能是參與植物防御反應，以抵御病原物和草食動物的危害。太子參皂苷是太子參中主要藥效成分，具有抗疲勞、耐缺氧、耐低溫作用，能增加免疫器官的重量，并能激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功

2、能。
　　3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A還原酶（HMGR）是植物皂苷主要的合成途徑——甲羥戊酸途徑（MVA途徑）中催化 HMG-CoA還原形成甲羥戊酸（MVA）限速酶，該反應不可逆，被認為是MVA途徑的第一個限速反應，具有重要意義。通過太子參 HMGR基因編碼序列的克隆和功能研究有助于理解太子參皂苷的合成與代謝相關研究，提高其皂苷含量，創(chuàng)造良好經(jīng)濟效益。目前對太子參的研究主要集中于栽培和常規(guī)育種方面，相關的分子生物學研究不夠深入

3、，特別是關于其活性成分分子調(diào)控機制的研究目前還是空白。
　　本研究以太子參拓參1號為植物材料，通過 RACE技術克隆 HMGR全長cDNA序列，構(gòu)建其重組表達載體，轉(zhuǎn)化煙草K326品種中，并對轉(zhuǎn)基因植株的HMGR酶活及總皂苷含量測定與分析。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）通過提取太子參總RNA，利用RACE和RT-PCR等技術對太子參皂苷合成途徑中的關鍵酶基因 HMGR進行分離鑒定，獲得到一條長度2137bp的序列，該序列含一

4、個1674 bp的可譯閱讀框，編碼557個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為59.327 kDa，等電點（pI）值為7.58。經(jīng)相似性分析，源于太子參HMGR的氨基酸序列與人參HMGR的一致性為76.7％，與擬南芥HMGR的一致性為77.7%，與刺五加 HMGR、蘿卜 HMGR的一致性為77.1%，推測獲得的序列為太子參HMGR侯選基因。
　　（2）將獲得的HMGR基因 ORF序列與真核表達載體 pRi101-AN進行連接，獲得重組質(zhì)粒p

5、Ri-HMGR，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法浸染煙草K326，經(jīng)PCR檢測，共獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株30株，轉(zhuǎn)化率為93.75%。
　?。?）利用微波處理等方法提取轉(zhuǎn)HMGR煙草與非轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)基中的總皂苷，通過香草醛-高氯酸反應體系法測定皂苷含量，結(jié)果表明，種植轉(zhuǎn) HMGR煙草分泌到培養(yǎng)基中的皂苷類物質(zhì)的含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草，最高達16.64%，約為非轉(zhuǎn)基因植株的兩倍，表明外源HMGR在煙草中得到表達，并提高了煙草總?cè)频暮俊?br>