LEAFY基因轉(zhuǎn)化蘋果實生苗及其成花特異蛋白的分離的研究.pdf

1、本研究以蘋果實生苗為試材，建立了其葉片不定芽的高效再生體系，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將LEAFY基因轉(zhuǎn)入蘋果雜交種中，以期獲得含有LEAFY基因的蘋果新種質(zhì)，為蘋果成花機理的研究打下基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下： 1.研究了激素種類、濃度、暗處理時間以及葉片放置方式對蘋果實生苗繼代和葉片不定芽再生的影響，結(jié)果表明：70％乙醇處理10s+0.1％HgC12溶液處理5min是蘋果種子和莖段的最佳消毒方法，繼代培養(yǎng)基MS+NAA0.1mg/L+BA0

2、.5mg/L，生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA1..mg/L+7-14 d暗處理，再生培養(yǎng)基MS+NAA0.4mg/L+TD22.0mg/L+21d葉片暗處理，并且葉片遠(yuǎn)軸面接觸培養(yǎng)基，葉片不定芽再生率達(dá)到100％ 2.應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以蘋果實生苗組培苗的葉片為受體材料，進(jìn)行了不同選擇壓、農(nóng)桿菌侵染時間、共培養(yǎng)時間、抑菌素濃度等遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的研究，建立了蘋果雜交種遺傳轉(zhuǎn)化體系為：在農(nóng)桿菌菌液中添加150mg/LAS，葉片經(jīng)農(nóng)桿

3、菌浸染5min后。在蘋果雜交種再生培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2d、然后加入cef300mg/L和km15mg/L進(jìn)入光照培養(yǎng)，能獲得最佳的GUS基因瞬時表達(dá)率為41.4％。 3.利用GUS組織化學(xué)染色，PCR乖RT-PCR擴(kuò)增的方法對蘋果雜交種的km抗性植株進(jìn)行了初步檢測，結(jié)果表明表明，LEAFY基因已經(jīng)整合進(jìn)2個株系的基因組中，并且能夠正常表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)率0.5％ 4.利用雙向凝膠電泳分離轉(zhuǎn)基因和對照植株的蛋白質(zhì)，經(jīng)PDQuest軟件