桔小實蠅保幼激素信號通路Met和Kr-h1基因功能初探.pdf

1、桔小實蠅 Bactrocera dorsalis(Hendel)隸屬雙翅目Diptera、實蠅科Tephritidae，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。由于極強的環(huán)境適應和擴散入侵能力，桔小實蠅被多個國家和地區(qū)列為檢疫性害蟲，對國際貿(mào)易造成了諸多限制；同時由于其寄主范圍廣、繁殖力強、造成的經(jīng)濟損失嚴重，因此該蟲是果蔬上的危險性害蟲。桔小實蠅一生經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲四個發(fā)育階段，其成蟲將卵產(chǎn)于果皮之下，幼蟲孵化后取食果肉，造成果實脫落或失去

2、經(jīng)濟價值。變態(tài)發(fā)育作為桔小實蠅重要的生理過程，具有重要的研究意義。在昆蟲中，蛻皮激素和保幼激素協(xié)同作用，共同參與調(diào)控昆蟲的蛻皮和變態(tài)發(fā)育。相對于蛻皮激素信號通路，保幼激素（Juvenile hormone,JH）分子作用機制還遠未清楚。
　　本學位論文基于桔小實蠅基因組及轉錄組數(shù)據(jù)庫信息，運用RT-PCR技術，從桔小實蠅體內(nèi)克隆獲得了JH信號通路基因Met和Kr-h1的開放閱讀框（ORF），并對其特征序列進行了注釋；利用qPCR技

3、術解析了桔小實蠅Met和Kr-h1的時空表達模式，同時明確和記錄了外源激素（JH III和烯蟲酯Methoprene）處理后桔小實蠅幼蟲及蛹的應激表達模式及其表型變化；在此基礎上，利用RNAi探索了Met和Kr-h1在桔小實蠅變態(tài)發(fā)育過程中的功能。研究結果不僅有助于了解昆蟲生長發(fā)育機理，還有利于尋找新的殺蟲靶標，為實蠅類害蟲的持續(xù)防控提供新的思路和方法。主要研究結果如下：
　　1.桔小實蠅JH信號通路Met和Kr-h1基因的克隆與

4、序列分析
　　基于桔小實蠅基因組和轉錄組數(shù)據(jù)庫，克隆獲得了JH信號通路Met和Kr-h1基因的ORF，并推導了其編碼的氨基酸序列。進一步利用Scanprosite、NetNGlyc1.0、SignalP4.1以及TMHMM等生物信息學軟件分析了Met、Kr-h1基因推導的蛋白質(zhì)的保守序列、跨膜結構等潛在的生理功能。
　　2.桔小實蠅JH信號通路Met和Kr-h1基因的時空表達模式
　　2.1 桔小實蠅JH信號通路Met

5、和Kr-h1基因在不同發(fā)育階段的表達模式
　　利用qPCR技術解析了JH信號通路Met、Kr-h1基因在桔小實蠅卵、幼蟲、蛹及成蟲1日齡的mRNA表達模式。結果表明，Met基因在桔小實蠅整個發(fā)育階段持續(xù)表達，但幼蟲期的表達量明顯高于蛹期。幼蟲期呈現(xiàn)不規(guī)律的波浪形起伏，在末齡期的第9日齡達到高峰，之后在蛹期持續(xù)低表達，推測該基因在桔小實蠅變態(tài)發(fā)育的過程中起著重要作用。
　　Kr-h1基因變化更為顯著，其在卵期有較高的相對表達量

6、，而在幼蟲第3、4日齡有明顯的下調(diào)現(xiàn)象，在進入3齡幼蟲期的第5日齡開始出現(xiàn)持續(xù)上調(diào)直至蛹期第1日齡，同樣在即將化蛹的幼蟲第9日齡出現(xiàn)高峰。此外，Met、Kr-h1基因均在蛹-成蟲的轉變過程中出現(xiàn)上調(diào)。Kr-h1基因在響應桔小實蠅JH變化過程中發(fā)揮了極大的作用，是桔小實蠅變態(tài)發(fā)育的重要調(diào)控因子。
　　2.2 桔小實蠅JH信號通路Met和Kr-h1基因在幼蟲不同組織的表達模式
　　利用qPCR技術解析了JH信號通路Met、Kr-

7、h1基因在桔小實蠅3齡幼蟲脂肪體、馬氏管、中腸、氣管和表皮組織中的表達模式。結果表明，2個基因均在桔小實蠅幼蟲馬氏管中表達量最高，其次為脂肪體，而分別在幼蟲氣管、中腸中表達量最低。
　　3.JH III和Methoprene對桔小實蠅Met和Kr-h1基因表達的影響
　　3.1 JH III和Methoprene對桔小實蠅幼蟲Met和Kr-h1基因表達的影響
　　利用點滴法分別對桔小實蠅4日齡幼蟲施用JH III和Me

8、thoprene。于處理后的6h、10h和24h，分別檢測桔小實蠅Met、Kr-h1基因的表達量。qPCR結果表明，兩種化合物均對Met基因無明顯的刺激作用；兩種激素處理后的24h，Kr-h1基因表達量均出現(xiàn)顯著性上調(diào)，最終導致幼蟲在化蛹后形態(tài)上出現(xiàn)了介于幼蟲和蛹之間的“中間形態(tài)”。此外，相對JH III，Kr-h1基因?qū)ethoprene更敏感。
　　3.2 JH III和Methoprene對桔小實蠅蛹Met和Kr-h1基因

9、表達的影響
　　利用點滴法分別對桔小實蠅初蛹（12 h）施用JH III和Methoprene。于處理后的1d、3d、5d、7d，分別檢測桔小實蠅Met和Kr-h1基因的表達量。qPCR結果表明，兩種激素處理對Met基因表達量無顯著影響；而Kr-h1基因表達水平在激素處理下顯著上調(diào)，其中Methoprene處理后的第7天，Kr-h1上調(diào)倍數(shù)達到79.5，最終導致桔小實蠅蛹由于不能正常羽化而死亡。
　　4.桔小實蠅Met和Kr

10、-h1基因的功能初探
　　分別將合成好的Met、Kr-h1基因dsRNA混入染料胭脂蟲紅，對桔小實蠅4日齡幼蟲進行飼喂法RNA干擾，并通過qPCR技術檢測目的基因的沉默效果。結果表明，在iMet處理24h后，與對照相比，Met基因表達水平顯著下調(diào)56.2％，同時Kr-h1基因表達量也受到顯著抑制，分別下調(diào)了71.1%（24h）和42.3%（48h）；在iKr-h1處理24h和48h后，Kr-h1基因表達水平分別顯著下調(diào)78.9%和