桔小實蠅Tachykinin和Natalisin信號系統(tǒng)的生理功能及其藥靶潛力評估.pdf

1、桔小實蠅是重要的農(nóng)業(yè)害蟲，由于寄主范圍廣、適應能力強以及抗藥性發(fā)展快速等因素，對其持續(xù)防控愈發(fā)困難。神經(jīng)肽是昆蟲體內(nèi)一種重要的信號分子，通過激活G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）調(diào)控昆蟲多種生理功能，阻斷或擾亂神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的信號傳導，能夠達到控制害蟲的目的。因此，神經(jīng)肽信號系統(tǒng)被認為是一種理想的殺蟲劑靶標。本學位論文基于桔小實蠅基因組和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous sy

2、stem）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學方法，對桔小實蠅神經(jīng)肽前體基因進行鑒定及注釋；克隆獲得2個近似神經(jīng)肽Tachykinin（Tachykinin related-peptide，TRP）和Natalisin（NTL）前體及其受體基因的 cDNA序列，并解析了桔小實蠅 TRP（BdTRP）和 NTL（BdNTL）及其受體（BdTRPR和 BdNTLR）基因結(jié)構(gòu)信息；采用實時定量 PCR（qPCR）技術(shù)，分析BdTRP和 BdNTL及其受

3、體在桔小實蠅體內(nèi)的時空表達模式；運用免疫組化（Immunohistochemistry）和熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization）技術(shù)，定位桔小實蠅腦部表達 BdTRP和 BdNTL的神經(jīng)元；通過 RNA干擾（RNA interference，RNAi）、觸角電位（Electroantennogram，EAG）以及行為學分析技術(shù)和方法，確定桔小實蠅TRP和NTL信號系統(tǒng)承擔的具體生理功能；利用

4、中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞表達系統(tǒng)及胞內(nèi)鈣離子流動測定技術(shù)，分別對 BdTRPR和 BdNTLR進行功能性測定及藥理學分析，并以此建立靶向BdTRPR和BdNTLR的激動劑和拮抗劑的高通量篩選平臺；最后，利用該篩選平臺對13個神經(jīng)肽類似物進行了靶向活性篩選和評價。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴基于桔小實蠅基因組和中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定及注釋了39個桔小實蠅的神經(jīng)肽前體基因。序列分析結(jié)

5、果發(fā)現(xiàn)，桔小實蠅大多數(shù)神經(jīng)肽前體具有典型的結(jié)構(gòu)特征，即“信號肽+成熟肽+前體相關(guān)肽”；成熟肽的切割位點保守，一般為賴氨酸殘基（K）和精氨酸殘基（R）組合；大多數(shù)成熟肽C端具有酰胺化修飾位點。此外，Adipokinetic hormone、Allatostatin C（AST-C）、Corazonin和Diuretic hormone44成熟肽的N端存在谷氨酸環(huán)化形成的焦谷氨酸；AST-C、Allatostatin CC（AST-CC）、

6、Crustacean cardioactive peptide、CCHamide、CNMamide、Insulin-like peptide和Neuroparsin成熟肽的半胱氨酸之間存在二硫鍵；Sulfakinin成熟肽具有1個硫酸化的酪氨酸；CNMamide、Ion transport peptide和Orcokinin的前體基因存在選擇性剪接現(xiàn)象；神經(jīng)肽Neuropeptide F存在基因復制現(xiàn)象。⑵利用qPCR技術(shù)解析桔小實蠅B

7、dTRP和BdTRPR的時空表達模式。結(jié)果表明，BdTRP和BdTRPR均在桔小實蠅的成蟲期表達水平相對較高，在幼蟲和蛹期的表達水平相對較低；值得注意的是，卵期BdTRPR的表達水平最高，而BdTRP的表達水平相對較低。桔小實蠅BdTRP和BdTRPR組織特異性的表達模式分析結(jié)果表明，BdTRP主要在桔小實蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)和中腸高水平表達，而其受體 BdTRPR在成蟲組織中的表達較為廣泛，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、中腸、后腸及觸角均能檢測到表達。⑶

8、利用qPCR技術(shù)解析桔小實蠅BdNTL和BdNTLR的時空表達模式。結(jié)果表明，BdNTL和BdNTLR均在蛹和成蟲期的表達水平相對較高，在幼蟲期的表達水平相對較低，卵期BdNTL的表達水平最高，而其受體BdNTLR的表達水平則較低。桔小實蠅BdTRP和BdTRPR組織特異性的表達模式分析結(jié)果表明，BdNTL主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高水平表達，而其受體 BdNTLR除在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達外，在后腸、觸角、卵巢和精巢也有一定的表達水平。利用免疫組化

9、和熒光原位雜交技術(shù)，分別在蛋白和mRNA水平對桔小實蠅成蟲腦部分泌BdNTL的神經(jīng)元進行定位分析。免疫組化分析結(jié)果顯示，在蛋白水平，桔小實蠅成蟲的腦部有13對神經(jīng)元分泌 BdNTL。其中，DLP和前腦間部小神經(jīng)元各有2對神經(jīng)元分泌BdNTL，PDLP有7對神經(jīng)元分泌BdNTL。此外，在前背外側(cè)中間神經(jīng)元（Anterior dorsolateral interneuron，ADLI）和下對側(cè)中間神經(jīng)元（Inferior contralat

10、eral interneuron，ICLI）各有1對神經(jīng)元分泌BdNTL。熒光原位雜交結(jié)果顯示，在mRNA水平，發(fā)現(xiàn)在DLP、ADLI和ICLI各有1對神經(jīng)元表達BdNTL。在幼蟲腦部表達BdNTL的神經(jīng)元較少，免疫組化分析結(jié)果顯示，在幼蟲腦部有6對神經(jīng)元分泌BdNTL，而熒光原位雜交分析結(jié)果顯示幼蟲腦部僅有2對神經(jīng)元表達BdNTL。⑷利用CHO細胞表達系統(tǒng)實現(xiàn)對桔小實蠅TRP和NTL受體的功能性表達，采用細胞內(nèi)鈣離子流動測定的方法建立

11、兩個受體的功能測定體系。利用該技術(shù)體系，測定了TRP和NTL受體各自內(nèi)源配體的有效中濃度（50%effective concentration，EC50），并以此確定各自的模式配體。結(jié)果顯示，BdTRP5為BdTRPR的模式配體，BdNTL2為BdNTLR的模式配體。活性測定結(jié)果表明，BdNTL2能在1μM濃度下完全激活 BdTRPR，而同樣濃度的 BdTRP5也能完全激活 BdNTLR，說明在離體條件下，兩個信號系統(tǒng)間存在交互效應。⑸

12、利用該技術(shù)體系搭建靶向BdTRPR和BdNTLR的激動劑和拮抗劑的高通量篩選平臺，對13個NTL/TRP類似物進行激動劑和拮抗劑活性測定。結(jié)果表明，13個化合物均無靶向 BdNTLR的有效激動劑或拮抗劑的活性?；衔?888[Φ1]wp-4和2120[Φ1]wp-1具有明顯的靶向 BdTRPR的激動劑活性，且對BdTRPR的激活能力呈濃度依賴性關(guān)系，EC50值分別為4.9 nM和268.8 nM?；衔?887[Φ1]wp-3具有靶向B