葉下珠復方抗HBV、人肝癌裸鼠移植瘤及其分子生物學機制探討.pdf

1、一、研究目的體外觀察葉下珠復方抗HBV及抑制HBsAg、HBeAg分泌的作用，在動物體內觀察葉下珠復方對免疫性肝損傷的保護作用，并初步揭示其護肝機制；研究葉下珠復方的體內和體外抗腫瘤活性，并探討其抗腫瘤的分子生物學機制。 二、實驗步驟1.觀察葉下珠復方體外抗HBV的作用2.葉下珠復方抗ConA所致的免疫性肝損傷3.葉下珠復方對人肝癌HePG2細胞體外增殖的抑制作用4.建立人肝癌HePG2裸鼠移植瘤模型5.葉下珠復方的體內抗腫瘤作

2、用6.用RT-PCR、分子克隆、基因序列測定和免疫組化等方法觀察葉下珠復方對移植瘤裸鼠p53、c-myc基因表達的調節(jié)作用。 三、實驗方法1.以2.2.15細胞為模型，根據MTT法檢測葉下珠復方的細胞毒性。用公式求算出藥物的最大無毒濃度及半效致死量TC50。將2.2.15細胞按1×105/ml接種24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1.2ml，次日棄培養(yǎng)液。以不同藥物對2.2.15細胞的最大無毒劑量為起始濃度，加入培養(yǎng)液稀釋(系列2倍稀釋)的

3、不同濃度的不同藥物，每濃度6孔，每3天換含藥物的培養(yǎng)液一次，同時設不加藥物對照。收集每次換液的培養(yǎng)上清250ul，-20℃凍存，集中用ELISA法測定HBsAg、HBeAg，并計算藥物對抗原的抑制率、半數(shù)有效濃度(IC50)和治療指數(shù)(TI)，判斷藥物效果，用熒光定量PCR測定HVB-DNA。 2.NIH小鼠48只隨機分為6組，每組8只，分別為空白對照組，模型對照組，葉下珠復方大、中、小劑量組(40g/kg、20g/kg、10g

4、/kg)，聯(lián)苯雙酯(150mg/kg)治療組，除空白對照組外，其余小鼠于實驗首日上午尾靜脈注射ConA20mg/kg，4h后各組開始灌胃給藥，空白對照組和模型對照組均灌等量生理鹽水，次日晨開始第二次給藥，第三天給藥后4h第二次尾靜脈注射ConA20mg/kg，8h后取摘眼球取血，賴氏法檢測ALT、AST，ELISA法檢測TNF-α和IL-8含量。肝臟取出后取左葉中性甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡觀察病理切片并拍照。

5、3.取對數(shù)生長期的HePG2細胞消化、計數(shù)，以2.5×104/孔種植于96孔板中，培養(yǎng)24小時后，加入不同濃度的葉下珠復方50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml分別培養(yǎng)24h、48h和72h，對照組加入等體積培養(yǎng)液，每濃度組每時間段設6個平行孔。根據MTT法檢測葉下珠復方的半數(shù)有效濃度和各濃度的細胞增殖抑制率，用流式細胞儀分析細胞周期和各藥物處理組不同時間段的凋亡率，透射電鏡觀察葉下珠復方對HePG2細胞超

6、微結構的影響。制作細胞爬片，葉下珠復方處理后用Hoect33258熒光染色，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡率。 4.將人肝癌HePG2細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用含0.02％EDTA的0.125％胰酶消化，PBS洗滌細胞兩次，1000rpm離心3min，生理鹽水調整細胞懸液濃度至1×108/ml，每只裸鼠項肩部皮下注射0.2ml。接種細胞第二天后，將裸鼠隨機分為3組，分別是葉下珠復方治療組，生理鹽水組(陰性對照)，5-Fu組(陽性對照組)。

7、治療組每天用葉下珠復方灌胃10g/kg，陰性對照組每天口服同體積生理鹽水，5-Fu組(陽性對照組)，腹腔注射5-Fu20mg/kg.d，每周給藥二次。觀察裸鼠成瘤情況和精神、飲食、活動、大小便等一般情況，每周用游標卡尺測量瘤體最大長度(a)、寬度(b)和高度(c)，根據公式V=ab2/2，計算腫瘤體積，并畫出腫瘤體積時間生長曲線。給藥35天后經裸鼠眼眶靜脈叢取血后處死裸鼠(分離血清-20℃凍存?zhèn)溆?，剝離瘤組織，并稱瘤重，迅速置于液氮罐

8、中凍存。放免法檢測各組裸鼠血清中外周血甲胎球蛋白(AFP)含量，瘤體經10％中性福爾馬林固定，石蠟切片，HE常規(guī)染色，光鏡下觀察、拍照，觀察其病理組織學改變。 5.將各組裸鼠瘤組織的RNA提取后逆轉錄，RT-PCR擴增p53和C-myc基因。應用NIHimage1.60軟件分析不同實驗組p53和C-mycPCR產物的電泳條帶，對擴增產物進行半定量分析。將表達的p53基因與pTARGETTM載體的連接，轉化入JM109感受態(tài)菌中，

9、篩選陽性克隆提取細菌質粒進行酶切鑒定，菌液送英駿廣州測序公司測序。裸鼠瘤組織以石蠟包埋制成4um厚的切片，以SP法檢測p53蛋白和C-myc蛋白表達。 四、結果1.在半數(shù)毒性濃度下，葉下珠復方濃度為250ug/ml、125ug/ml、62.5ug/ml、31.25ug/ml、15.6ug/ml時對2.2.15細胞分泌HBsAg的抑制率分別為54.8％、43.6％、37.4％、26.7％、14.6％，其TI值為6.1；對HBeAg

10、的抑制率分別為78.6％、72.9％、67.1％、56.8％、51.5％，其TI值為24.6。不同濃度的葉下珠復方對2.2.15細胞分泌的HBV-DNA抑制率不同，隨著藥物濃度的增加，HBV-DNA定量逐漸降低。但在1000ug/ml時由于藥物的毒性作用所致細胞死亡，大量病毒由細胞釋出，HBV-DNA絕對量反而增加。 2.在血清生化檢查的結果中，模型組ALT、AST及TNF-α、IL-8水平明顯高于空白對照組，其差異有顯著性意義

11、(p＜0.01)，說明造模成功。葉下珠復方各劑量組ALT、AST及TNF-α、IL-8活性均低于模型組，其差異有顯著性意義(p＜0.01)，說明葉下珠復方各劑量組均對ALT、AST及TNF-α、IL-8有顯著降低作用。葉下珠復方各劑量組ALT、AST與聯(lián)苯雙酯組比較無顯著意義(p＞0.05)，但葉下珠復方各劑量組TNF-α水平與聯(lián)苯雙酯組比較有顯著性意義(p＜0.05)，說明葉下珠復方各劑量組對TNF-α的降低效果優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組，聯(lián)苯雙

12、酯組對TNF-α無降低作用。在葉下珠復方各劑量組之間比較，大、中劑量組與小劑量組之間有顯著性差異(p＜0.05)，大劑量和中劑量組優(yōu)于小劑量組。肝組織病理切片顯示，空白組小鼠肝小葉排列整齊，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇未見異常。模型組肝細胞濁脹、輕度脂肪變性，有的呈氣球樣變，可見明顯點狀壞死及大片灶狀壞死，壞死灶周圍可見大量炎性細胞浸潤，Kupffer細胞增加。聯(lián)苯雙酯組病變較輕，但該組仍有少量標本小葉結構明顯破壞，各標本均

13、有小灶性壞死和肝細胞濁腫，Kupffer細胞輕度增加，少數(shù)血管出現(xiàn)輕度浸潤；葉下珠復方小劑量組與聯(lián)苯雙酯組相當，小部分標本仍可見大面積灶性壞死，各標本均有小灶性壞死、肝細胞濁腫、輕度脂肪變性，大部分血管出現(xiàn)極輕度圍管浸潤，Kupffer細胞輕度增加；葉下珠復方中劑量組未見大面積灶性壞死，各標本仍見肝細胞濁腫，輕度脂肪變性，小部分血管出現(xiàn)極輕度圍管浸潤，可見小面積局灶性壞死，Kupffer細胞輕度增加；葉下珠復方大劑量組肝細胞排列整齊，部

14、分肝組織可見散在點狀壞死和灶性壞死，肝細胞損傷程度明顯減輕，炎性細胞浸潤顯著減少。少數(shù)血管出現(xiàn)極輕度圍管浸潤，輕度灶性壞死，余未見異常。 5.腫瘤生長曲線顯示對照組腫瘤呈遞增性生長，而葉下珠復方治療組和5-Fu組生長曲線則較為低平，腫瘤生長明顯受到抑制。葉下珠復方治療組抑瘤率為32.5％，5-Fu組為30.8％，均與對照組有明顯差異(p＜0.05)。裸鼠移植瘤組織的病理學觀察，瘤組織間有較多粗細不一的纖維組織將瘤細胞分隔成巢狀，

15、部分癌細胞呈梁狀，腺腔狀排列，可見較多發(fā)育不完整的血竇結構，大多數(shù)細胞呈三角形，胞漿豐富，較多嗜酸性顆粒，胞核大小形態(tài)極不規(guī)則，核漿比例增大，可見較多病理性核分裂象，瘤巨細胞偶見。葉下珠復方治療組瘤塊中癌細胞排列散亂，有大量核固縮或碎裂的表現(xiàn)為凋亡狀態(tài)的細胞和不同程度壞死；5-Fu組瘤塊內有片狀壞死，但細胞排列較為整齊。 6.葉下珠復方治療組有p53基因表達，生理鹽水及5-Fu組均未見p53明顯表達。對該表達的p53基因進行克隆

16、和序列測定，證實該表達的p53基因為野生型。三組均有不同程度的c-myc基因表達，以β-acting為內參照，分別對各組所出現(xiàn)的特異性擴增條帶進行半定量分析，結果顯示：葉下珠復方治療組c-myc表達量明顯低于生理鹽水及5-Fu組(p＜0.05)。各組未見p53蛋白表達，進一步說明葉下珠復方組表達的為野生型p53基因。三組均有C-myc蛋白胞漿陽性表達，葉下珠復方治療組、5-FU組c-myc蛋白表達均較陰性對照組低(P＜0.01)，但葉下

17、珠復方治療組和5-FU組c-myc蛋白表達組間無明顯差異(p＞0.05)。 五、結論1.葉下珠復方有體外抗HBV作用。 2.葉下珠復方對Con-A所致的免疫性肝損傷有保護作用，其機制與降低TNF-α和IL-8等介導肝損傷的細胞因子分泌有關。 3.葉下珠復方對人肝癌HePG2細胞的體外增殖有抑制作用，阻滯細胞周期，誘導肝癌細胞凋亡可能是其機制之一。 4.葉下珠復方有體內抗腫瘤活性，對人肝癌裸鼠移植瘤的生長有