枇杷花期調(diào)控的分子生物學(xué)研究.pdf

1、枇杷(Eriobotrya Lindl.)為薔薇科枇杷屬植物，該屬包含二三十種，不同種間花期差異明顯，并且有一些枇杷種類的花期是可變的，或稱可塑的。例如，普通枇杷在秋冬季節(jié)開(kāi)花；臺(tái)灣枇杷為春季開(kāi)花；而臺(tái)灣枇杷恒春變型在原產(chǎn)地臺(tái)灣春季開(kāi)花，引種到廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)枇杷種質(zhì)資源圃以及廣州市果樹所后卻變?yōu)榍锒_(kāi)花。然而，迄今為止，關(guān)于枇杷花期的分子生物學(xué)方面的研究甚少，并且未見(jiàn)涉及野生枇杷及花期差異的研究。本研究一方面從枇杷成花的基礎(chǔ)方面入手，

2、進(jìn)行了枇杷花期相關(guān)基因的克隆、表達(dá)分析和功能驗(yàn)證的初步探索；另一方面對(duì)花期不同的枇杷屬材料花芽分化前及花芽分化期間的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，深入研究枇杷花芽分化起始過(guò)程中基因轉(zhuǎn)錄的動(dòng)態(tài)變化，為花期調(diào)控的分子生物學(xué)研究提供了大量信息，希望為揭示枇杷花期調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為生產(chǎn)實(shí)踐中人工調(diào)控花果發(fā)育，以及培育不同成熟期新品種提供理論依據(jù)，并為其它木本果樹的成花機(jī)理研究提供借鑒。主要結(jié)果如下：
　　(1)對(duì)兩種不同花期野生枇杷臺(tái)灣枇杷

3、(E.deflexaNakai)和臺(tái)灣枇杷恒春變型(E.deflexa f.koshunensis Nakai)的莖頂端進(jìn)行切片觀察，結(jié)果顯示臺(tái)灣枇杷恒春變型在9月底至10月初就已經(jīng)開(kāi)始花芽分化，而臺(tái)灣枇杷11月才開(kāi)始，表明不同枇杷種或變型之間花期不同是因?yàn)樗鼈兓ㄑ糠只_(kāi)始的時(shí)間即已有不同。同時(shí)對(duì)普通枇杷開(kāi)花時(shí)間不同的兩個(gè)品種‘早鐘6號(hào)’和‘解放鐘’的莖頂端在不同發(fā)育階段的觀察，發(fā)現(xiàn)‘早鐘6號(hào)’和‘解放鐘’開(kāi)花時(shí)間差異則不是因?yàn)榛ㄑ糠只?/p>

4、起始時(shí)間的不同，而主要是因?yàn)樗鼈兓ㄐ虬l(fā)育快慢不同。
　　(2)從臺(tái)灣枇杷恒春變型中成功得到FT、CO、GI、SOC1和PIF4同源基因各一個(gè)，及FD和SVP同源基因各兩個(gè)，分別命名為EdFT、EdCO、EdGI、EdSOC1、EdPIF4、EdFD1、EdFD2、EdSVP1和EdSVP2。對(duì)這些基因預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明它們都具有各基因所特有的保守氨基酸殘基或結(jié)構(gòu)域。
　　(3)亞細(xì)胞定位顯示EdFT、E

5、dSVP1和EdSVP2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，而EdFD1、EdFD2、EdCO、EdGI、EdSOC1和EdPIF4只定位于細(xì)胞核。
　　(4)在擬南芥中過(guò)表達(dá)EdFT、EdFD1、EdFD2、EdCO、EdGI和EdSOC1均表現(xiàn)出早花表型，說(shuō)明它們具有保守的促進(jìn)開(kāi)花的功能。晝夜節(jié)律表達(dá)分析表明EdGI、EdCO和EdFT的表達(dá)均隨晝夜變化而變化，受光周期影響。BiFC實(shí)驗(yàn)證明EdFT可以和EdFD1/2在體內(nèi)發(fā)生蛋白水

6、平上的互作。這些都進(jìn)一步證明這些基因是擬南芥相應(yīng)基因的同源基因，可能具有類似的功能。
　　(5)時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，EdFD1、EdFD2和EdSOC1可能對(duì)臺(tái)灣枇杷恒春變型花芽分化起正調(diào)控作用，EdSVP1起負(fù)調(diào)控作用；而在普通枇杷‘解放鐘’和‘早鐘6號(hào)’中，除了EdFD1和EdSOC1，EdCO和EdFT可能也對(duì)花芽分化起正調(diào)控作用，而EdFD2卻沒(méi)有明顯影響。
　　(6)對(duì)臺(tái)灣枇杷和臺(tái)灣枇杷恒春變型花芽分化前及花芽分化期

7、間的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，總計(jì)產(chǎn)出74314777320 nt數(shù)據(jù)，組裝得到總unigene116674個(gè)。共有94459個(gè)unigene獲得注釋信息。注釋結(jié)果有39221個(gè)unigene匹配到COG分類的25個(gè)功能類別，有66514個(gè)unigene注釋到GO類別的55個(gè)功能組。共預(yù)測(cè)得到CDS88481條。這為枇杷花期調(diào)控進(jìn)一步研究提供了豐富的序列和生物學(xué)信息。
　　(7)差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)不同樣品間差異表達(dá)基因數(shù)量較多。采用W

8、GCNA構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了28個(gè)模塊。對(duì)lightcyan模塊進(jìn)行KEGG功能分析，發(fā)現(xiàn)該模塊顯著富集的代謝途徑包括：晝夜節(jié)律－植物，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化，苯丙氨酸代謝，次生代謝物生物合成，倍半萜和三萜生物合成，苯丙烷生物合成，類胡蘿卜素生物合成，半胱氨酸和甲硫氨酸代謝。其中植物晝夜節(jié)律和類胡蘿卜素生物合成代謝通路可能在枇杷花期調(diào)控中起重要作用，為后續(xù)功能和調(diào)控機(jī)制研究打開(kāi)通道。
　　(8)與擬南芥開(kāi)花相關(guān)基因進(jìn)行同源